Этапы проведения цитогенетического анализа: от взятия крови до микроскопа

Цитогенетический анализ (ЦГА) — это фундаментальное исследование, позволяющее изучить полный набор хромосом человека, его кариотип. Для многих пациентов направление на такой анализ становится поводом для беспокойства, в основном из-за непонимания того, что происходит за дверями лаборатории. На самом деле, все этапы проведения цитогенетического анализа представляют собой четко отлаженный и стандартизированный процесс. Он начинается с простого забора венозной крови и заканчивается тщательным изучением хромосом под микроскопом, что дает возможность выявить численные и структурные аномалии, лежащие в основе многих генетических заболеваний. Понимание каждого шага этого пути помогает снять тревогу и осознанно подойти к диагностике.

Подготовка к исследованию: что нужно знать пациенту

Специальная сложная подготовка для проведения цитогенетического анализа крови в большинстве случаев не требуется. Не нужно соблюдать строгую диету или приходить натощак. Однако существует несколько важных моментов, которые напрямую влияют на качество будущего исследования. Ключевая задача — получить живые, способные к делению клетки (лимфоциты), поэтому важно минимизировать факторы, которые могут на них повлиять.

Основные рекомендации перед сдачей крови на ЦГА:

• Информирование врача. Обязательно сообщите врачу, назначившему анализ, обо всех принимаемых лекарственных препаратах. Особое значение имеют антибиотики, цитостатики и некоторые другие группы медикаментов, которые могут подавлять деление клеток. Врач может порекомендовать временно отменить препарат или перенести исследование.
• Состояние здоровья. Проведение кариотипирования не рекомендуется во время острых инфекционных заболеваний (например, ОРВИ с высокой температурой). Лучше дождаться полного выздоровления и сдавать кровь через 1-2 недели после нормализации состояния.
• Алкоголь. За несколько дней до сдачи анализа следует воздержаться от употребления алкоголя, так как он может негативно сказаться на жизнеспособности клеток.

Соблюдение этих простых правил повышает вероятность того, что в лаборатории получат качественный материал, пригодный для культивирования и последующего анализа хромосомного набора.

Первый этап: забор венозной крови

Процедура забора материала для цитогенетического исследования ничем не отличается от обычного взятия крови из вены. Медицинский работник обрабатывает локтевой сгиб антисептиком и производит венепункцию. Для анализа требуется небольшой объем крови, обычно от 2 до 5 мл.

Ключевое отличие заключается в пробирке, в которую собирают кровь. Для ЦГА используют специальные пробирки, содержащие антикоагулянт — вещество, препятствующее свертыванию крови. Чаще всего это гепарин. Важно, чтобы антикоагулянт не только сохранял кровь в жидком состоянии, но и не был токсичен для лимфоцитов, ведь именно эти клетки станут основой для дальнейшего исследования. После взятия пробирка с кровью маркируется и в кратчайшие сроки доставляется в цитогенетическую лабораторию.

Культивирование клеток: создание условий для роста

Это самый длительный и один из самых ответственных этапов цитогенетического анализа. Дело в том, что в периферической крови лимфоциты находятся в состоянии покоя и не делятся. А увидеть хромосомы можно только в момент клеточного деления (митоза). Чтобы заставить клетки делиться, их помещают в искусственные условия, имитирующие среду человеческого организма.

Процесс культивирования включает:

1. Выделение лимфоцитов. Из цельной крови выделяют фракцию, богатую лимфоцитами.
2. Помещение в питательную среду. Клетки помещают во флаконы со специальной питательной средой, которая содержит все необходимые для их жизни и роста компоненты: аминокислоты, витамины, соли и сыворотку.
3. Стимуляция деления. В среду добавляют специальное вещество — митоген (чаще всего фитогемагглютинин, ФГА). Он действует как «толчок», заставляя покоящиеся лимфоциты вступать в процесс активного деления.
4. Инкубация. Флаконы с клетками помещают в термостат, где поддерживается постоянная температура 37°C, оптимальная для роста человеческих клеток. Культивирование обычно длится 72 часа.

Именно необходимость культивирования объясняет, почему результаты ЦГА нельзя получить за один день. Этот этап требует времени, стерильных условий и строгого контроля со стороны лаборантов.

Остановка клеточного деления и подготовка хромосом

После трехдневного культивирования в питательной среде находится множество делящихся клеток. Но для анализа хромосом нужна определенная стадия деления — метафаза. Именно в метафазе хромосомы достигают максимальной конденсации (уплотнения), становятся короткими, толстыми и хорошо различимыми под микроскопом. Чтобы «поймать» как можно больше клеток именно на этой стадии, в культуру добавляют специальное вещество, например, колхицин. Он разрушает нити веретена деления, и процесс митоза останавливается на метафазе.

Далее следует несколько важных манипуляций:

• Гипотоническая обработка. Клетки обрабатывают гипотоническим раствором (раствором с низкой концентрацией солей). Из-за разницы осмотического давления вода устремляется внутрь клеток, они набухают. Это приводит к тому, что хромосомы внутри клетки расходятся друг от друга и не склеиваются, что критически важно для их последующего анализа.
• Фиксация. Клетки обрабатывают фиксатором (смесь метанола и уксусной кислоты). Этот процесс убивает клетки, останавливая все биохимические реакции, и консервирует их структуру, в том числе и структуру хромосом. Фиксацию повторяют несколько раз, чтобы полностью отмыть клетки.

Приготовление препаратов и окрашивание для анализа

После всех подготовительных этапов получают суспензию зафиксированных клеток. Теперь нужно приготовить препараты для микроскопии. Для этого капли клеточной суспензии с высоты наносят на холодные, чистые и обезжиренные предметные стекла. При ударе о стекло оболочка клетки разрушается, и хромосомы, находившиеся внутри, равномерно распределяются по поверхности. Полученный препарат называют «метафазной пластинкой».

Чтобы хромосомы стали хорошо видны и их можно было идентифицировать, препараты окрашивают специальными красителями. Наиболее распространенным методом является G-окрашивание (окрашивание по Гимзе с предварительной обработкой трипсином). В результате этой процедуры на каждой хромосоме появляется уникальный индивидуальный рисунок из чередующихся темных и светлых полос (дисков). Этот рисунок напоминает штрих-код и позволяет не только отличить одну хромосому от другой, но и выявить даже самые мелкие структурные перестройки.

Микроскопия и кариотипирование: финальный анализ

Завершающий этап проведения цитогенетического анализа — это работа врача-цитогенетика. Специалист изучает окрашенные препараты под микроскопом при большом увеличении. Его задача — найти метафазные пластинки с хорошим качеством и расположением хромосом, после чего провести их детальный анализ.

В ходе анализа врач:

1. Подсчитывает общее количество хромосом. В норме у человека их 46 (23 пары). Любое отклонение от этого числа (например, 47 или 45) указывает на численную аномалию.
2. Анализирует структуру каждой хромосомы. Врач внимательно изучает рисунок полос на каждой хромосоме, сравнивая его с эталонным. Это позволяет выявить структурные аномалии: делеции (потеря участка), дупликации (удвоение участка), инверсии (поворот участка на 180 градусов), транслокации (обмен участками между разными хромосомами).
3. Составляет кариограмму. Используя специальное программное обеспечение, врач фотографирует несколько метафазных пластинок, вырезает изображения всех хромосом и систематизирует их — располагает парами от самой большой (1-я пара) до самой маленькой (22-я пара) и добавляет половые хромосомы (XX у женщин, XY у мужчин). Полученное упорядоченное изображение и называется кариограммой.

На основании проведенного анализа врач-цитогенетик формирует заключение, в котором описывает кариотип пациента в соответствии с международной номенклатурой (ISCN).

Для наглядности, все ключевые этапы цитогенетического исследования можно свести в таблицу.

Сколько времени занимает цитогенетический анализ и почему

Общая продолжительность цитогенетического исследования от момента сдачи крови до получения результата обычно составляет от 14 до 21 дня. Пациентов часто удивляет такой длительный срок. Однако, как видно из описанных этапов, ускорить этот процесс невозможно без потери качества. Основное время (около 3 дней) уходит на культивирование клеток — это биологический процесс, который нельзя форсировать.

Остальное время требуется на кропотливую лабораторную работу по приготовлению препаратов и, что самое важное, на их тщательный анализ врачом. Цитогенетик должен изучить не одну, а несколько десятков клеток, чтобы исключить случайные ошибки и составить достоверное заключение. Такой многоступенчатый и ответственный подход гарантирует высокую точность и надежность цитогенетического анализа — золотого стандарта в диагностике хромосомных патологий.

Список литературы

1. Гинтер Е.К. Медицинская генетика: учебник. — М.: Медицина, 2003. — 448 с.
2. Бочков Н.П. Клиническая генетика: Учебник. — 4-е изд., доп. и перераб. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. — 592 с.
3. Клинические рекомендации «Цитогенетическое исследование (кариотип)». Российское общество медицинских генетиков. — М., 2018.
4. Jorde L.B., Carey J.C., Bamshad M.J. Medical Genetics. — 6th ed. — Elsevier, 2020. — 384 p.
5. Gersen S.L., Keagle M.B. The Principles of Clinical Cytogenetics. — 4th ed. — Springer, 2021. — 721 p.
6. Nussbaum R.L., McInnes R.R., Willard H.F. Thompson & Thompson Genetics in Medicine. — 8th ed. — Saunders, 2016. — 544 p.