Метод mFISH для детального анализа всех хромосом человека: что это такое

Метод mFISH, или многоцветная флуоресцентная гибридизация in situ, представляет собой высокотехнологичный цитогенетический анализ, который позволяет визуализировать и изучить весь набор хромосом человека. Его уникальность заключается в способности «окрашивать» каждую из 23 пар хромосом в свой индивидуальный, легко различимый цвет. Это создает своего рода цветную карту генома, на которой любые структурные перестройки — даже самые сложные и скрытые — становятся заметными. Данное исследование является одним из самых точных инструментов для выявления комплексных хромосомных аномалий, которые невозможно или крайне сложно определить с помощью стандартных методов.

Что такое многоцветная флуоресцентная гибридизация in situ и в чем ее суть

Суть метода mFISH заложена в его названии. «Многоцветная» означает, что используется палитра из множества флуоресцентных красителей. «Флуоресцентная» указывает на то, что эти красители светятся под воздействием света определенной длины волны, что позволяет увидеть их в специальном микроскопе. «Гибридизация in situ» переводится как «соединение на месте» и описывает сам процесс: специально созданные ДНК-зонды, помеченные красителями, находят и связываются с комплементарными им участками на хромосомах прямо в ядре клетки.

Если представить хромосомный набор в виде библиотеки из 23 пар томов, то стандартный анализ (кариотипирование) позволяет увидеть, все ли тома на месте и не порваны ли у них страницы. Но если кто-то вырвал главу из одного тома и вклеил ее в другой, заметить это будет сложно. Метод мФИШ решает эту проблему, присваивая каждому тому (паре хромосом) свой уникальный цвет обложки. Теперь, если даже небольшой фрагмент «синего» тома окажется в «красном», это сразу бросится в глаза. Именно эта способность детально анализировать структуру и выявлять обмен участками между разными хромосомами делает многоцветную флуоресцентную гибридизацию in situ незаменимой в сложных диагностических случаях.

Как работает метод mFISH: пошаговое объяснение

Процесс анализа с помощью многоцветной флуоресцентной гибридизации in situ — это сложная многоэтапная лабораторная процедура, требующая высокой квалификации специалистов и специализированного оборудования. Для пациента все начинается со сдачи биологического материала, а дальнейшая «магия» происходит в стенах цитогенетической лаборатории.

Вот как выглядит этот процесс в упрощенном виде:

• 1. Получение образца. Для исследования необходимы живые клетки, способные к делению. Чаще всего используют лимфоциты из венозной крови. В пренатальной диагностике это могут быть клетки амниотической жидкости или хориона, а в онкологии — клетки костного мозга или опухолевой ткани. Сама процедура забора материала стандартна и не отличается от обычного анализа крови или амниоцентеза.
• 2. Культивирование клеток. Полученные клетки помещают в специальную питательную среду и стимулируют их деление. Это необходимо, чтобы «поймать» хромосомы в тот момент, когда они максимально компактны и хорошо видны — в стадии метафазы клеточного деления.
• 3. Подготовка хромосом. Клетки на стадии метафазы обрабатывают специальными растворами, чтобы остановить деление, разрушить клеточную оболочку и распределить хромосомы на предметном стекле.
• 4. Гибридизация. На стекло с хромосомами наносится «коктейль» из ДНК-зондов. Каждый тип зонда специфичен для определенной хромосомы и несет уникальную комбинацию из нескольких флуоресцентных красителей. Стекло нагревают, чтобы двойная спираль ДНК хромосом «расплелась», позволяя зондам связаться с соответствующими им участками.
• 5. Визуализация и анализ. Препарат исследуют под флуоресцентным микроскопом, оснащенным специальными светофильтрами. Сложная компьютерная программа анализирует комбинацию сигналов от красителей для каждой хромосомы и присваивает ей свой условный, легко различимый глазом цвет (псевдоцвет). В результате получается яркое изображение всех 46 хромосом, где каждая пара имеет свой уникальный оттенок.
• 6. Составление заключения. Врач-цитогенетик внимательно изучает полученную цветную кариограмму, выявляя любые отклонения: обмены участками между разными хромосомами (транслокации), наличие дополнительных фрагментов неизвестного происхождения и другие сложные перестройки.

Когда назначают анализ mFISH: основные показания

Метод mFISH не является рутинным исследованием. Это инструмент «второй линии», который применяют в ситуациях, когда стандартные методы, в первую очередь кариотипирование с G-окрашиванием, не дают полной картины или их результаты неоднозначны. Решение о необходимости проведения такого сложного анализа принимает врач-генетик.

Основные ситуации, в которых может быть рекомендована многоцветная флуоресцентная гибридизация in situ:

• Идентификация маркерных хромосом. Если при стандартном кариотипировании обнаруживается дополнительная хромосома или ее фрагмент, но определить его происхождение (от какой именно хромосомы он отделился) невозможно, mFISH помогает точно установить «родительскую» хромосому.
• Уточнение сложных хромосомных перестроек. Когда кариотип показывает, что в аномалию вовлечены три и более хромосомы (например, сложная транслокация), только мФИШ может точно показать, какие именно участки и между какими хромосомами переместились.
• Подозрение на скрытые (субмикроскопические) транслокации. В некоторых случаях бесплодия, привычного невынашивания беременности или рождения ребенка с аномалиями развития стандартный кариотип у родителей может быть в норме, но есть подозрение на очень маленький обмен участками, невидимый при обычном анализе.
• Онкогематология. В раковых клетках, особенно при лейкозах и лимфомах, часто возникают многочисленные и сложные хромосомные аномалии. Анализ mFISH помогает детально охарактеризовать геном опухоли, что важно для прогноза и выбора тактики лечения.

Сравнение mFISH с другими цитогенетическими методами

Для лучшего понимания места метода mFISH в арсенале генетической диагностики полезно сравнить его с другими ключевыми исследованиями. У каждого из них есть своя область применения, свои сильные и слабые стороны.

Ниже представлена сравнительная таблица основных методов анализа хромосом:

Что можно увидеть с помощью многоцветной флуоресцентной гибридизации in situ

Результат анализа mFISH — это детализированная карта хромосомного набора. Она позволяет специалисту с высокой точностью идентифицировать целый ряд аномалий, которые остаются невидимыми или неясными при других исследованиях.

С помощью мФИШ можно обнаружить и охарактеризовать:

• Сбалансированные и несбалансированные транслокации. Это обмен участками между хромосомами. Метод mFISH особенно ценен для выявления сложных транслокаций, когда в обмене участвуют три или более хромосомы.
• Инсерции. Встраивание фрагмента одной хромосомы в другую.
• Маркерные хромосомы. Анализ точно показывает, из материала какой хромосомы состоит этот дополнительный неопознанный фрагмент.
• Комплексные перестройки в клетках опухолей. Позволяет увидеть хаотичные изменения, характерные для многих видов рака.
• Кольцевые хромосомы и другие редкие структурные аномалии.

Важно понимать, что многоцветная флуоресцентная гибридизация in situ — это метод для выявления структурных, а не количественных аномалий. Хотя он и может подтвердить изменение числа хромосом (например, трисомию), для первичной диагностики таких состояний существуют более простые и быстрые методы.

Преимущества и ограничения метода мФИШ

Как и любой сложный диагностический инструмент, многоцветная флуоресцентная гибридизация in situ имеет свои сильные стороны и определенные рамки применения. Объективная оценка преимуществ и ограничений помогает понять, в каких случаях этот метод будет наиболее эффективен.

Преимущества:

• Высокая информативность. Позволяет одновременно проанализировать структуру всех 24 типов хромосом (22 аутосомы + X и Y) в одной клетке.
• Точность в сложных случаях. Является незаменимым инструментом для расшифровки запутанных и неоднозначных кариотипов.
• Наглядность. Цветное изображение хромосом значительно упрощает визуальное обнаружение аномальных обменов генетическим материалом.

Ограничения:

• Ограниченное разрешение. Метод мФИШ не способен выявлять очень мелкие перестройки, такие как микроделеции или микродупликации, для обнаружения которых предназначен хромосомный микроматричный анализ.
• Не видит сбалансированные инверсии. Если участок хромосомы просто переворачивается на 180 градусов без потери материала, mFISH этого не покажет.
• Трудоемкость и стоимость. Это сложный, длительный и дорогостоящий анализ, требующий специального оборудования и высококвалифицированных специалистов.
• Не определяет точечные мутации. Данный метод анализирует хромосомы целиком, но не может «читать» саму последовательность ДНК и выявлять изменения в отдельных генах.

В заключение, метод mFISH является мощным дополнением к классической цитогенетике. Он не заменяет другие методы, а работает в тандеме с ними, позволяя врачам-генетикам получать максимально полную и точную информацию о структуре хромосомного набора в самых сложных диагностических ситуациях.

Список литературы

1. Гинтер Е.К. Медицинская генетика: Учебник. — М.: Медицина, 2003. — 448 с.
2. Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б., Чернышов В.Н. Медицинская цитогенетика: учебное пособие. — М.: Медпрактика-М, 2006. — 300 с.
3. Nussbaum R.L., McInnes R.R., Willard H.F. Thompson & Thompson Genetics in Medicine. 8th ed. — Philadelphia: Elsevier, 2016. — 544 p.
4. Speicher M.R., Gwyn Ballard S., Ward D.C. Karyotyping human chromosomes by combinatorial multi-fluor FISH // Nature Genetics. — 1996. — Vol. 12(4). — P. 368-375.
5. Gersen S.L., Keagle M.B. The Principles of Clinical Cytogenetics. 3rd ed. — New York: Springer, 2013. — 612 p.