Этапы секвенирования по Сэнгеру от образца ДНК до готового анализа

Этапы секвенирования по Сэнгеру представляют собой последовательный лабораторный процесс, который позволяет с высочайшей точностью «прочитать» нуклеотидную последовательность конкретного участка дезоксирибонуклеиновой кислоты. Этот метод, считающийся «золотым стандартом» в диагностике многих моногенных заболеваний, преобразует биологический материал, например каплю крови, в детальный генетический отчет. Понимание того, как устроен этот многоступенчатый путь от взятия образца до получения результата, помогает развеять тревоги и осознать всю сложность и надежность современной генетической диагностики.

Подготовка образца ДНК для исследования

Первый и основополагающий этап — это получение качественной дезоксирибонуклеиновой кислоты из биологического материала пациента. В качестве исходного материала чаще всего используют венозную кровь, но также могут применяться клетки соскоба со слизистой оболочки щеки, слюна или другие ткани. Главная задача на этой стадии — выделить ДНК, очистив ее от всех остальных клеточных компонентов: белков, липидов, РНК. Чистота образца критически важна, так как любые примеси могут помешать последующим реакциям и привести к искажению результатов.

После выделения проводится оценка качества и количества полученной дезоксирибонуклеиновой кислоты. Специалисты используют методы спектрофотометрии или флуориметрии, чтобы убедиться, что ДНК имеется в достаточном количестве и она не повреждена. Только образцы, прошедшие этот строгий контроль, допускаются к следующему этапу анализа.

Полимеразная цепная реакция для амплификации ДНК

Чтобы прочитать последовательность интересующего гена, его сначала необходимо «размножить». Для этого используется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Интересующий участок ДНК слишком мал, чтобы работать с ним напрямую. Процесс ПЦР позволяет создать миллионы и миллиарды точных копий именно того фрагмента гена, который подлежит исследованию.

Для запуска реакции в пробирку с ДНК пациента добавляют специальные компоненты: фермент ДНК-полимеразу, нуклеотиды (строительные блоки для новых цепей ДНК) и праймеры. Праймеры — это короткие, искусственно синтезированные последовательности, которые «узнают» и связываются с началом и концом нужного участка гена, работая как закладки в книге. Они указывают полимеразе, какой именно фрагмент нужно копировать. Полимеразная цепная реакция проходит в несколько циклов нагревания и охлаждения, в ходе каждого из которых количество копий целевого фрагмента удваивается. В результате получается достаточное количество материала для проведения секвенирования.

Терминаторная реакция — сердце метода Сэнгера

Это ключевой этап, который и лежит в основе метода, разработанного Фредериком Сэнгером. После амплификации полученные копии фрагмента ДНК используются в новой реакции, называемой циклическим секвенированием. В этой реакции, помимо обычных нуклеотидов (A, T, G, C), используются их модифицированные «аналоги» — дидезоксинуклеотиды (ddNTPs).

Каждый из четырех дидезоксинуклеотидов (ddA, ddT, ddG, ddC) помечен флуоресцентной краской своего цвета. Особенность этих модифицированных нуклеотидов в том, что после их встраивания в растущую цепь ДНК дальнейшее ее удлинение становится невозможным — происходит обрыв, или терминация, цепи. В результате реакции в пробирке образуется огромное количество фрагментов ДНК разной длины. Каждый фрагмент представляет собой копию исходного участка, оборванную на определённой позиции, и последний нуклеотид в каждом таком фрагменте — это светящийся дидезоксинуклеотид. Таким образом, мы получаем набор фрагментов, где длина каждого соответствует позиции нуклеотида, а цвет метки — его типу (A, T, G или C).

Капиллярный электрофорез для разделения фрагментов

После терминаторной реакции необходимо отсортировать полученные миллионы фрагментов ДНК по длине, чтобы определить их последовательность. Для этого используется метод капиллярного электрофореза. Смесь фрагментов помещается в тончайшую капиллярную трубку, заполненную специальным гелем, и подвергается воздействию электрического поля.

Поскольку молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты заряжены отрицательно, они начинают двигаться к положительному полюсу. Гель в капилляре действует как сито: короткие фрагменты движутся сквозь него быстрее, а длинные — медленнее. На конце капилляра установлен лазерный детектор, который считывает цвет флуоресцентной метки каждого фрагмента, проходящего через него. Так как фрагменты выходят из капилляра строго в порядке увеличения их длины (от самого короткого до самого длинного), детектор последовательно регистрирует цвета меток. Эта последовательность цветов и есть искомая последовательность нуклеотидов в исследуемом участке ДНК.

Анализ данных и расшифровка результатов секвенирования по Сэнгеру

Информация от детектора поступает в компьютер, где специальная программа преобразует флуоресцентные сигналы в график, называемый электрофореграммой или хроматограммой. На этом графике каждый нуклеотид представлен пиком определённого цвета: например, зеленый для аденина (A), синий для цитозина (C), черный (или желтый) для гуанина (G) и красный для тимина (T). Высота и четкость пиков говорят о качестве прочтения.

Врач-лабораторный генетик или биолог анализирует эту хроматограмму. Он сравнивает полученную последовательность ДНК пациента с референсной (эталонной, «нормальной») последовательностью этого гена, которая хранится в международных базах данных. Цель — выявить любые отличия (варианты или мутации): замены одного нуклеотида на другой, выпадения (делеции) или вставки (инсерции) нуклеотидов. Обнаруженные изменения оцениваются на предмет их клинической значимости — могут ли они быть причиной заболевания. На основе этого анализа формируется заключение для лечащего врача и пациента.

Контроль качества на каждом этапе исследования

Надежность метода Сэнгера обеспечивается строгим контролем качества на всех этапах процесса. Это многоуровневая система проверки, которая сводит к минимуму вероятность ошибки.

Вот основные точки контроля, которые проходит каждый образец:

• Входной контроль биоматериала: Оценка качества и количества выделенной ДНК. Образцы с недостаточной концентрацией или высокой степенью деградации не допускаются к анализу.
• Контроль ПЦР-амплификации: После «размножения» фрагмента гена проводится его проверка с помощью гель-электрофореза, чтобы убедиться, что скопировался именно нужный участок и в достаточном количестве.
• Оценка качества секвенирования: Анализ полученной электрофореграммы на предмет четкости пиков, отсутствия фонового «шума» и других артефактов. Если качество прочтения неудовлетворительное, реакцию повторяют.
• Двунаправленное секвенирование: Для повышения надежности часто проводят чтение одного и того же участка ДНК в двух направлениях (прямом и обратном). Результаты затем сравнивают, что позволяет исключить случайные ошибки прибора.

Факторы, влияющие на сроки выполнения анализа

Пациентов часто волнует, почему генетический анализ занимает от нескольких дней до нескольких недель. Длительность исследования по методу Сэнгера зависит от множества факторов, каждый из которых требует времени.

Ниже представлена таблица с основными факторами и их влиянием на общие сроки.

Список литературы

1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки. В 3-х томах. — М.: Мир, 1994.
2. Гинтер Е.К. Медицинская генетика: Учебник. — М.: Медицина, 2003. — 448 с.
3. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. В 2-х томах. — М.: Мир, 1998.
4. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. ПЦР «в реальном времени». — М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. — 223 с.
5. Brown T.A. Genomes. 4th edition. — New York: Garland Science, 2017. — 640 p.