Секвенирование по Сэнгеру: золотой стандарт генетической диагностики

Секвенирование по Сэнгеру представляет собой фундаментальный метод в медицинской генетике, позволяющий с высочайшей точностью определить нуклеотидную последовательность конкретного участка ДНК. Несмотря на появление новых технологий, этот подход остается «золотым стандартом» для подтверждения точечных мутаций и диагностики многих наследственных заболеваний. Его суть заключается в прицельном «прочтении» гена, что дает возможность выявить или исключить генетическую причину болезни, уточнить диагноз и составить дальнейший план ведения пациента. Понимание принципов, возможностей и ограничений этого анализа помогает осознанно подойти к генетическому тестированию.

Что такое метод Сэнгера и почему его называют золотым стандартом

Прямое секвенирование по Сэнгеру — это лабораторный метод, который позволяет установить точный порядок нуклеотидов (химических «букв» А, Т, Г, Ц) в определенном фрагменте ДНК. Представьте, что ген — это предложение в книге, а мутация — опечатка. Метод Сэнгера позволяет прочитать это предложение буква за буквой и найти ошибку. Этот процесс включает в себя создание множества копий исследуемого участка ДНК разной длины, каждая из которых заканчивается на определенном нуклеотиде, помеченном флуоресцентным красителем. Затем эти фрагменты разделяются по размеру, и специальный прибор (секвенатор) считывает цвет метки каждого фрагмента, восстанавливая исходную последовательность.

Статус «золотого стандарта» секвенирование по Сэнгеру получило благодаря своей исключительной точности, достигающей 99,99%. Когда необходимо подтвердить наличие конкретной, уже известной или предполагаемой мутации, именно этот метод дает наиболее достоверный результат. В отличие от более масштабных исследований, которые анализируют сразу тысячи генов и могут давать неоднозначные данные, прямое секвенирование целенаправленно проверяет одну конкретную «гипотезу». Поэтому его часто используют для валидации, то есть окончательного подтверждения находок, полученных другими, менее точными, но более производительными методами, такими как секвенирование нового поколения (NGS).

Показания к проведению прямого секвенирования: когда назначают анализ

Назначение генетического анализа — это всегда взвешенное решение врача, основанное на клинической картине, семейной истории и результатах других обследований. Метод Сэнгера применяется в ситуациях, когда есть четкое подозрение на конкретное заболевание или мутацию.

Вот основные клинические ситуации, в которых может быть рекомендовано секвенирование по Сэнгеру:

• Диагностика моногенных заболеваний. Это самая частая причина. Если у пациента есть симптомы, характерные для заболевания, вызванного мутацией в одном гене (например, муковисцидоз, фенилкетонурия, синдром Марфана, нейрофиброматоз), анализ назначается для подтверждения диагноза.
• Подтверждение результатов других генетических тестов. Если при проведении масштабного исследования (например, секвенирования экзома или генома) был обнаружен клинически значимый вариант, его необходимо подтвердить более точным методом. Для этой цели идеально подходит прямое секвенирование.
• Определение носительства рецессивных мутаций. Это важно при планировании семьи. Если в семье были случаи наследственных заболеваний, будущие родители могут пройти тест, чтобы узнать, являются ли они носителями «поломанного» гена.
• Фармакогенетическое тестирование. Анализ определенных генов помогает предсказать реакцию организма на некоторые лекарственные препараты, подобрать эффективную дозировку и избежать побочных эффектов.
• Дифференциальная диагностика. Когда у нескольких заболеваний схожие симптомы, метод Сэнгера помогает исключить или подтвердить каждое из них поочередно, проверяя соответствующие гены.

Как проходит процедура секвенирования: от подготовки до получения результата

Для пациента весь процесс генетического тестирования состоит из нескольких понятных этапов. Понимание каждого шага помогает снизить тревожность и правильно подготовиться к исследованию. Обычно путь от назначения анализа до получения заключения занимает от нескольких недель до месяца.

Процесс можно разделить на следующие ключевые этапы:

1. Консультация врача-генетика. Это первый и самый важный шаг. Специалист оценивает клиническую картину, собирает семейный анамнез, определяет, какой именно ген или участки генов необходимо исследовать, и объясняет возможные результаты анализа.
2. Подготовка к сдаче биоматериала. В большинстве случаев для анализа используется венозная кровь. Специальной диеты или сложной подготовки не требуется. Рекомендуется не принимать пищу за 2–3 часа до сдачи крови. Если для анализа используется слюна или соскоб со слизистой щеки, важно за час до сбора материала не есть, не пить, не курить и не чистить зубы.
3. Сдача биоматериала. Процедура забора крови ничем не отличается от обычного анализа и занимает несколько минут. Это стандартная и безопасная манипуляция.
4. Лабораторный этап. После поступления образца в лабораторию из него выделяют ДНК. Затем нужный участок гена многократно копируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) для получения достаточного количества материала. Далее проводятся непосредственно реакция секвенирования и анализ на автоматическом секвенаторе. Этот этап полностью автоматизирован и проходит без участия пациента.
5. Анализ данных и формирование заключения. Полученную последовательность ДНК сравнивают с эталонной (референсной). Врач-лабораторный генетик анализирует выявленные отличия (варианты) и определяет, являются ли они причиной заболевания. На основе этого анализа составляется официальное заключение.
6. Повторная консультация врача-генетика. Получив результаты, необходимо снова обратиться к врачу. Специалист подробно объяснит, что означает заключение, и даст рекомендации по дальнейшим действиям, лечению или профилактике. Интерпретировать результаты самостоятельно крайне не рекомендуется, так как это может привести к неверным выводам и необоснованной тревоге.

Метод Сэнгера и секвенирование нового поколения (NGS): в чем разница

В современной генетике существуют два основных подхода к «чтению» ДНК: секвенирование по Сэнгеру и секвенирование нового поколения (NGS). Это не взаимозаменяемые, а скорее взаимодополняющие технологии, каждая из которых имеет свою область применения. Выбор метода зависит от клинической задачи.

Чтобы понять их ключевые отличия, рассмотрим их сравнительную характеристику в таблице.

Таким образом, если врач подозревает конкретное заболевание, например, муковисцидоз, он назначит прицельное секвенирование гена CFTR методом Сэнгера. Если же симптомы не укладываются в картину одной болезни и необходимо проверить сразу несколько сотен генов, связанных с задержкой развития, целесообразнее использовать NGS.

Что означают результаты анализа и как их интерпретировать

Получение генетического заключения — волнительный момент. Важно понимать, что бланк с результатом — это не окончательный диагноз, а информация для лечащего врача. Только специалист может правильно соотнести данные анализа с состоянием здоровья пациента.

Возможны три основных варианта заключения:

• Патогенный вариант не обнаружен. Это означает, что в исследованном участке гена не найдено мутаций, которые известны науке как вызывающие заболевание. Это значительно снижает вероятность того, что симптомы вызваны «поломкой» именно в этом гене. Однако это не исключает наличие мутаций в других, неисследованных генах или наличие другого, негенетического заболевания.
• Обнаружен патогенный/вероятно патогенный вариант. Это означает, что найдена мутация, которая с высокой долей вероятности является причиной заболевания. Такой результат подтверждает диагноз. Врач-генетик объяснит, как эта мутация влияет на здоровье, каков прогноз и какие существуют варианты лечения или ведения.
• Обнаружен вариант с неизвестной клинической значимостью (VUS). Это один из самых сложных для интерпретации результатов. Он означает, что в гене найдено изменение, но на сегодняшний день у науки недостаточно данных, чтобы однозначно сказать, вызывает оно болезнь или является безвредной индивидуальной особенностью. В такой ситуации может потребоваться дополнительное обследование, в том числе анализ ДНК у здоровых и больных родственников, а также динамическое наблюдение.

Главное правило — не пытаться интерпретировать результаты самостоятельно. Обсуждение заключения с врачом-генетиком поможет избежать неверных выводов, лишнего стресса и позволит составить четкий план дальнейших действий.

Преимущества и ограничения секвенирования по Сэнгеру

Как и любой метод диагностики, прямое секвенирование имеет свои сильные и слабые стороны. Их понимание позволяет врачу выбрать оптимальную стратегию генетического тестирования в каждой конкретной ситуации.

Ключевые преимущества метода Сэнгера:

• Высокая точность и надежность. Это основной козырь метода, который и делает его «золотым стандартом» для подтверждающей диагностики.
• Простота интерпретации результатов. Поскольку анализируется конкретный, небольшой участок ДНК, результаты обычно являются однозначными.
• Относительно невысокая стоимость. Анализ одного гена методом Сэнгера значительно дешевле, чем масштабные исследования NGS.

Вместе с тем у секвенирования по Сэнгеру есть и ряд ограничений:

• Низкая производительность. Метод не подходит для одновременного анализа большого количества генов. Это долго и дорого.
• Невозможность выявления новых мутаций. Прямое секвенирование предназначено для поиска мутаций в заранее определенных участках. Оно не подходит для «диагностического поиска», когда причина заболевания неизвестна.
• Ограничения в детекции некоторых типов мутаций. Метод плохо справляется с выявлением крупных структурных перестроек генома, таких как делеции (выпадение большого участка ДНК) или дупликации (удвоение).

Список литературы

1. Гинтер Е.К. Медицинская генетика: учебник. — М.: Медицина, 2003. — 448 с.
2. Бочков Н.П. Клиническая генетика: Учебник. — 4-е изд., доп. и перераб. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. — 592 с.
3. Муковисцидоз: определение, этиология и патогенез, клиническая картина, диагностика, лечение, диспансерное наблюдение. Клинические рекомендации. — Министерство здравоохранения Российской Федерации, 2021.
4. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. — 1977. — Vol. 74, № 12. — P. 5463–5467.
5. Nussbaum R.L., McInnes R.R., Willard H.F. Thompson & Thompson Genetics in Medicine. — 8th ed. — Elsevier, 2016. — 544 p.