Ограничения метода Сэнгера и ситуации, когда он неэффективен

Несмотря на то, что секвенирование по Сэнгеру десятилетиями считается «золотым стандартом» в генетической диагностике, важно понимать его ограничения и ситуации, когда он неэффективен. Этот метод обладает высокой точностью для анализа небольших, заранее известных участков ДНК, но его возможности не безграничны. Отрицательный результат, полученный с помощью метода Сэнгера, не всегда означает отсутствие генетической причины заболевания, а лишь указывает на то, что в проверенном фрагменте гена искомая мутация не найдена. Понимание границ этого исследования помогает врачам и пациентам правильно интерпретировать результаты и определять дальнейшую диагностическую тактику.

Почему «золотой стандарт» генетики не всегда дает ответ

Секвенирование по Сэнгеру — это метод, позволяющий с высочайшей точностью «прочитать» нуклеотидную последовательность конкретного, заранее выбранного фрагмента ДНК. Его можно сравнить с детальной проверкой одного слова или предложения в огромной книге. Если врач точно знает, в каком гене и в каком его участке вероятнее всего находится «опечатка» (мутация), этот метод идеально подходит для ее поиска и подтверждения.

Именно поэтому метод Сэнгера незаменим для:

• Подтверждения мутации, выявленной другими, менее точными методами.
• Поиска конкретной, известной мутации у родственников пациента.
• Диагностики моногенных заболеваний, вызванных частыми и хорошо изученными мутациями в одном гене.

Однако проблема заключается в том, что многие наследственные заболевания могут быть вызваны мутациями в разных генах (генетическая гетерогенность) или различными типами мутаций, которые этот метод просто не способен «увидеть». Он работает только при наличии четкой клинической гипотезы — «искать здесь». Если гипотеза неверна или причина заболевания сложнее, чем одна точечная мутация, секвенирование по Сэнгеру окажется неинформативным.

Ключевые технические и методические ограничения секвенирования по Сэнгеру

Существует ряд фундаментальных ограничений, которые определяют границы применимости этого метода в клинической практике. Понимание этих аспектов критически важно для корректной оценки диагностических возможностей исследования. Ниже приведены основные технические и методические недостатки.

• Низкая производительность. Метод Сэнгера позволяет анализировать только один короткий фрагмент ДНК за один раз. Если заболевание может быть вызвано мутациями в десятках или сотнях разных генов, последовательная проверка каждого из них этим методом становится чрезвычайно долгой, дорогой и нецелесообразной.
• Неспособность выявлять крупные структурные перестройки. Этот метод хорошо находит «опечатки» — замены, выпадения или вставки одной или нескольких «букв» (нуклеотидов) в гене. Однако он не может обнаружить крупные делеции (потерю большого фрагмента гена или целого гена), дупликации (удвоение фрагмента), инверсии или транслокации. Для него это все равно что пытаться найти пропавшую главу в книге, читая ее по одному предложению.
• Трудности с детекцией мозаицизма. Мозаицизм — это состояние, при котором в организме человека присутствуют две или более клеточные линии с разным генотипом. Если мутация присутствует не во всех клетках, а лишь в части из них, метод Сэнгера может быть недостаточно чувствительным, чтобы ее уловить. Он может просто «не заметить» мутантные клетки, если их процент в образце слишком мал.
• Проблемы с анализом повторяющихся последовательностей. В геноме есть участки с многократно повторяющимися комбинациями нуклеотидов (например, CAGCAGCAG...). Такие повторы могут вызывать серьезные заболевания (например, болезнь Гентингтона). Секвенирование по Сэнгеру часто дает сбои при прочтении таких участков, что приводит к неточным или неинтерпретируемым результатам.
• Необходимость точной предварительной гипотезы. Как уже упоминалось, для запуска анализа необходимо точно знать, какой ген и какой его участок нужно проверить. Метод не подходит для «диагностического поиска», когда у пациента есть неясная клиническая картина и круг подозреваемых генов слишком широк.

Ситуации, в которых метод Сэнгера может быть неэффективен

Чтобы наглядно продемонстрировать, когда классическое секвенирование может не справиться с диагностической задачей, рассмотрим несколько типичных клинических сценариев. В этих случаях выбор другого, более широкоформатного метода генетического анализа будет более оправданным.

Что делать, если секвенирование по Сэнгеру не дало результата

Получение отрицательного или неинформативного результата — это не тупик, а повод для дальнейшего диагностического поиска. Самый важный шаг в этой ситуации — повторная консультация с врачом-генетиком. Специалист проведет повторный анализ клинической картины, семейного анамнеза и результатов предыдущих исследований, чтобы выработать новую стратегию.

В зависимости от клинической ситуации, могут быть рекомендованы более современные и мощные методы генетической диагностики. К ним относятся:

• Секвенирование нового поколения (NGS). Эта технология позволяет одновременно анализировать большое количество генов (от нескольких десятков до всех генов сразу). Панели NGS, клиническое или полное секвенирование экзома (WES) являются следующими шагами при подозрении на генетически гетерогенные заболевания.
• Хромосомный микроматричный анализ (ХМА). Это «золотой стандарт» для выявления микроделеций и микродупликаций — тех самых крупных структурных перестроек, которые пропускает метод Сэнгера.
• Полное секвенирование генома (WGS). Наиболее комплексный тест, который анализирует не только кодирующие участки генов (как экзом), но и регуляторные, межгенные области ДНК.

Выбор конкретного метода зависит от множества факторов и определяется лечащим врачом. Главное — помнить, что современная генетика обладает широким арсеналом инструментов, и отрицательный результат одного теста часто является лишь отправной точкой для более глубокого и точного диагноза.

Список литературы

1. Гинтер Е.К. Медицинская генетика: Учебник. — М.: Медицина, 2003. — 448 с.
2. Бочков Н.П. Клиническая генетика: Учебник. — 4-е изд., доп. и перераб. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. — 592 с.
3. Nussbaum R.L., McInnes R.R., Willard H.F. Thompson & Thompson Genetics in Medicine. — 8th ed. — Elsevier, 2016. — 546 p.
4. Read A., Donnai D. Emery's Elements of Medical Genetics. — 15th ed. — Elsevier, 2017. — 448 p.
5. Молекулярно-генетическая диагностика моногенных заболеваний: методические рекомендации / ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. — М., 2019.