Понимать ограничения и возможные ошибки секвенирования нового поколения

Секвенирование нового поколения (Next-Generation Sequencing, СНП) произвело революцию в медицинской генетике, открыв беспрецедентные возможности для диагностики наследственных заболеваний, персонализированной медицины и научных исследований. Этот метод позволяет одновременно анализировать миллионы участков ДНК, значительно ускоряя и удешевляя процесс по сравнению с традиционным секвенированием по Сэнгеру. Однако, несмотря на всю свою мощь и широкое применение, секвенирование нового поколения не является абсолютно совершенным инструментом. Важно понимать ограничения и возможные ошибки секвенирования нового поколения, чтобы корректно интерпретировать результаты и принимать обоснованные медицинские решения. Знание этих нюансов помогает избежать ложных ожиданий и грамотно использовать потенциал современной генетической диагностики.

Почему важно знать об ограничениях секвенирования нового поколения

Понимание ограничений и возможных ошибок секвенирования нового поколения критически важно для всех участников процесса — от пациента до лечащего врача. Это знание позволяет избежать неверных выводов, повторных исследований и необоснованных тревог, а также правильно планировать дальнейшие действия. Представьте, что вы прошли генетическое исследование и получили результат, который не объясняет вашу клиническую картину, или, наоборот, выявил некое изменение, значение которого неясно. В таких ситуациях понимание природы метода секвенирования нового поколения и его потенциальных слепых зон поможет вам и вашему врачу принять взвешенное решение. Основные причины, по которым необходимо знать об этих нюансах, включают:

• Избежать ложных заключений: Непонимание ограничений может привести к ошибочным выводам о наличии или отсутствии заболевания, что, в свою очередь, может повлечь за собой неправильное лечение или его отсутствие.
• Правильная интерпретация результатов: Любой результат генетического теста — это лишь часть головоломки. Его необходимо рассматривать в контексте полной клинической картины, анамнеза и, при необходимости, результатов других исследований.
• Обоснованные ожидания: Пациенты часто ожидают от секвенирования нового поколения абсолютной и полной информации обо всех возможных генетических рисках. Осознание того, что метод имеет свои пределы, помогает сформировать реалистичные ожидания.
• Эффективное планирование диагностики: В некоторых случаях секвенирование нового поколения может быть не лучшим или не единственным выбором для диагностики. Зная его ограничения, можно дополнить или заменить его другими, более подходящими методами.

Основные технические ограничения метода секвенирования нового поколения

Технические аспекты секвенирования нового поколения играют ключевую роль в формировании его ограничений. Даже при использовании самого современного оборудования и высококачественных реагентов некоторые особенности самой технологии могут повлиять на полноту и точность получаемых данных. К техническим ограничениям секвенирования нового поколения относятся следующие аспекты:

• Неравномерное покрытие (глубина секвенирования): Глубина покрытия означает, сколько раз каждый участок ДНК был прочитан. Для достоверного обнаружения вариантов требуется достаточное покрытие (обычно от 30x для герминальных вариантов и значительно выше для соматического мозаицизма). Некоторые регионы генома могут быть недостаточно покрыты из-за особенностей их последовательности (например, высокой GC-составляющей) или технологических проблем, что делает невозможным обнаружение мутаций в этих областях.
• Ограничения чтения коротких последовательностей: Большинство платформ секвенирования нового поколения генерируют относительно короткие прочтения (обычно 50-300 пар оснований). Это затрудняет выравнивание в регионах с повторяющимися последовательностями или псевдогенами, где одинаковые или очень похожие участки ДНК встречаются в разных местах генома.
• Проблемы с высокоповторяющимися и GC-богатыми/бедными регионами: Участки ДНК с частыми повторами (например, тандемные повторы, сегментные дупликации) или экстремальным содержанием гуанина (G) и цитозина (C) плохо поддаются секвенированию нового поколения. Это связано с трудностями в амплификации и последующем выравнивании, что может приводить к пропускам или некорректному обнаружению вариантов в этих областях.
• Выявление крупных структурных перестроек: Секвенирование нового поколения отлично справляется с точечными мутациями и небольшими инсерциями/делециями. Однако выявление крупных структурных вариантов, таких как большие делеции, дупликации, инверсии или транслокации, может быть затруднено или вовсе невозможно с помощью стандартных подходов секвенирования нового поколения из-за ограничения коротких чтений и сложности биоинформатического анализа.

Биоинформатические вызовы и возможные ошибки интерпретации

После получения сырых данных секвенирования нового поколения начинается сложный этап биоинформатического анализа, который также сопряжен с определенными вызовами и потенциальными источниками ошибок. От качества этого анализа зависит точность и достоверность окончательного результата. К биоинформатическим ограничениям секвенирования нового поколения относятся следующие:

Таблица: Биоинформатические вызовы и их влияние на результаты секвенирования нового поколения

Биологические и клинические ограничения секвенирования нового поколения

Помимо технических и биоинформатических аспектов, существуют также биологические и клинические факторы, которые могут влиять на результаты секвенирования нового поколения и их интерпретацию. Эти ограничения подчеркивают, что генетический тест — это лишь один из инструментов в комплексной диагностике. При рассмотрении биологических и клинических ограничений секвенирования нового поколения важно учитывать следующее:

• Качество образца ДНК: Для успешного анализа требуется достаточное количество и высокое качество ДНК. Образцы с низким содержанием ДНК, деградированной ДНК или загрязненные посторонней ДНК (например, бактериальной или контаминацией чужеродной человеческой ДНК) могут привести к некачественным данным, неполному покрытию или ошибочному обнаружению вариантов.
• Мозаицизм низкого уровня: Если патогенный вариант присутствует только в небольшой доле клеток организма (мозаицизм), секвенирование нового поколения может его не обнаружить. Особенно это актуально для соматического мозаицизма, связанного с онкологическими заболеваниями или некоторыми врожденными пороками развития, где доля мутантных клеток может быть очень низкой в исследуемом образце.
• Генетическая гетерогенность заболеваний: Многие наследственные заболевания могут быть вызваны мутациями в разных генах (генетическая гетерогенность) или различными типами мутаций в одном и том же гене. Даже при полногеномном секвенировании могут существовать редкие или еще не описанные гены-кандидаты, которые не включены в стандартные панели для анализа.
• Эпигенетические изменения: Секвенирование нового поколения непосредственно исследует последовательность ДНК. Однако оно не дает информации об эпигенетических изменениях, таких как метилирование ДНК или модификации гистонов, которые могут значительно влиять на экспрессию генов и быть причиной заболеваний (например, синдром Прадера-Вилли или Ангельмана, вызванные эпигенетическими изменениями).
• Полигенные и многофакторные заболевания: Большинство распространенных заболеваний (сердечно-сосудистые, сахарный диабет 2 типа, многие психические расстройства) имеют полигенную природу, то есть вызываются взаимодействием множества генетических вариантов, каждый из которых оказывает малый эффект, в сочетании с факторами окружающей среды. Секвенирование нового поколения в текущем формате не способно однозначно предсказать риск развития таких заболеваний.
• Отсутствие данных о фенотипе: Генетические варианты всегда должны интерпретироваться в контексте клинических данных пациента (фенотипа). Без подробной информации о симптомах, анамнезе и родословной интерпретация даже известных патогенных вариантов может быть неточной, а выявление новых вариантов — значительно затруднено.

Что секвенирование нового поколения может не обнаружить

Важно понимать, что, несмотря на свои широкие возможности, секвенирование нового поколения имеет определенные "слепые зоны" и не способно выявить абсолютно все типы генетических изменений. Осознание этих пробелов помогает формировать реалистичные ожидания от диагностики. Секвенирование нового поколения может не обнаружить следующие типы генетических изменений:

• Крупные хромосомные перестройки: Значительные изменения в структуре хромосом, такие как транслокации, инверсии или крупные делеции/дупликации, размером более нескольких килобаз. Для их выявления часто требуются цитогенетические методы, такие как кариотипирование или хромосомный микроматричный анализ.
• Экспансии тринуклеотидных повторов: Некоторые наследственные заболевания, такие как синдром ломкой Х-хромосомы, хорея Гентингтона или миотоническая дистрофия, вызваны патологическим увеличением числа определенных тринуклеотидных повторов в генах. Стандартное секвенирование нового поколения часто не способно точно подсчитать количество этих повторов из-за их высокоповторяющейся природы.
• Изменения в митохондриальной ДНК: Хотя некоторые платформы секвенирования нового поколения могут анализировать митохондриальную ДНК, это не является стандартной частью большинства экзомных или геномных секвенирований. Для полной оценки митохондриальных заболеваний часто требуется отдельное секвенирование митохондриального генома.
• Эпигенетические модификации: Как уже упоминалось, секвенирование нового поколения не анализирует метилирование ДНК или модификации гистонов, которые регулируют активность генов. Для изучения эпигенетики требуются специализированные методы.
• Варианты в "темных" или неотсеквенированных регионах: Существуют участки генома, которые либо технически сложны для секвенирования нового поколения (например, теломеры, центромеры), либо содержат повторяющиеся последовательности, которые затрудняют выравнивание и анализ. Мутации в этих областях могут быть пропущены.
• Очень низкоуровневый мозаицизм: Хотя секвенирование нового поколения может обнаружить мозаицизм, чрезвычайно низкие уровни мутантных клеток (менее 5-10%, в зависимости от глубины покрытия) могут быть не идентифицированы или ошибочно приняты за фоновый "шум".

Как минимизировать риски и ошибки при секвенировании нового поколения

Несмотря на все ограничения, секвенирование нового поколения остается мощным инструментом. Однако существуют шаги, которые могут помочь минимизировать риски ошибок и повысить достоверность получаемых результатов. Чтобы максимально повысить надежность результатов секвенирования нового поколения, следует придерживаться следующих рекомендаций:

1. Выбор аккредитованной лаборатории: Обращайтесь только в лаборатории, которые имеют соответствующую аккредитацию и доказанный опыт в проведении генетических исследований. Качество оборудования, реагентов и квалификация персонала напрямую влияют на точность анализа.
2. Качественный забор и хранение образца: Тщательно соблюдайте протоколы забора и хранения биоматериала (крови, слюны, тканей). Неправильное обращение с образцом может привести к деградации ДНК, контаминации или недостаточному ее количеству, что повлияет на качество секвенирования.
3. Оптимальный выбор типа исследования: Обсудите с врачом, какой объем секвенирования нового поколения наилучшим образом соответствует вашей клинической ситуации.
• Панельное секвенирование фокусируется на известных генах, связанных с конкретным заболеванием, минимизируя случайные находки.
• Секвенирование экзома анализирует все белок-кодирующие участки генома и является хорошим компромиссом между широтой охвата и стоимостью.
• Полногеномное секвенирование изучает весь геном, но его биоинформатический анализ сложнее, а интерпретация требует больше ресурсов.
4. Клиническая интерпретация результатов: Результаты секвенирования нового поколения должен интерпретировать квалифицированный генетик или медицинский специалист, имеющий опыт работы с генетическими данными. Интерпретация должна проводиться в контексте полной клинической картины пациента, его семейного анамнеза и результатов других исследований.
5. Подтверждающие методы диагностики: При выявлении клинически значимых вариантов, особенно новых или не до конца изученных, рекомендуется подтвердить их другими методами. Например, секвенирование по Сэнгеру, флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) или хромосомный микроматричный анализ могут быть использованы для подтверждения специфических изменений или выявления крупных перестроек.
6. Повторный анализ данных: В случае неясных или отрицательных результатов, если клиническая картина остается подозрительной на генетическое заболевание, может быть рекомендован повторный биоинформатический анализ сырых данных через некоторое время. Базы данных и наши знания о геноме постоянно пополняются, и то, что было VUS вчера, сегодня может стать патогенным вариантом.

Список литературы

1. Методические рекомендации по применению методов молекулярной генетики для диагностики наследственных болезней и оценки генетического риска в клинической практике / Под редакцией Е.К. Гинтер, Р.А. Зинченко. — М.: ФГБНУ «МГНЦ», 2017.
2. Баранов В.С., Баранова Е.В., Иващенко Т.Э. и др. Геном человека и гены «предрасположенности». Введение в предиктивную медицину. — СПб.: Интермедика, 2000.
3. ACMG Standards and Guidelines for the Interpretation of Sequence Variants: A Joint Consensus Recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015 May;17(5):405–24. doi: 10.1038/gim.2015.30. Epub 2015 Mar 5.
4. Nussbaum R.L., McInnes R.R., Willard H.F. Thompson & Thompson Genetics in Medicine. — 8th ed. — Saunders, 2016.
5. Green R.C., Berg J.S., Grody W.W., et al. ACMG recommendations for reporting of incidental findings in clinical exome and genome sequencing. Genet Med. 2013 Jul;15(7):565–74. doi: 10.1038/gim.2013.73. Epub 2013 Jun 20.