Ограничения метода: что не может показать полногеномное секвенирование

В современной медицинской генетике полногеномное секвенирование, или ПГС, часто воспринимается как метод, способный ответить на все вопросы о наследственности и здоровье. Действительно, этот мощный инструмент позволяет прочитать практически всю последовательность ДНК человека, открывая доступ к огромному объему генетической информации. Благодаря ПГС ученые и врачи смогли совершить прорыв в понимании многих редких заболеваний, онкологических процессов и индивидуальных реакций на лекарства. Однако, несмотря на свои впечатляющие возможности, полногеномное секвенирование имеет определенные ограничения и не может показать абсолютно все типы генетических изменений или полностью объяснить сложные биологические процессы. Понимание этих ограничений критически важно для правильной интерпретации результатов, избегания ложных ожиданий и определения дальнейших диагностических шагов. В данной статье мы подробно рассмотрим, какие аспекты генетической информации остаются за пределами возможностей полногеномного секвенирования.

Полногеномное секвенирование: суть метода и его значимость

Полногеномное секвенирование, или WGS, представляет собой технологию, которая позволяет определить полную последовательность всех трех миллиардов пар оснований ДНК в геноме человека. Это означает прочтение не только кодирующих белок участков (экзонов), но и всех некодирующих областей, включая интроны, регуляторные элементы и межгенные промежутки. Такой всеобъемлющий анализ значительно превосходит возможности ранее доступных методов, таких как кариотипирование или секвенирование одного гена, и даже секвенирование экзома, которое фокусируется только на кодирующих областях.

Значимость полногеномного секвенирования трудно переоценить. Оно дает возможность обнаруживать точечные мутации (изменения одной "буквы" ДНК), небольшие вставки или выпадения (инделы), а также некоторые крупные структурные перестройки, которые могут быть причиной наследственных заболеваний, предрасположенности к мультифакториальным болезням или влиять на эффективность лечения. Благодаря WGS врачи могут находить генетические причины редких и недиагностированных состояний, персонализировать подходы к терапии, например, в онкологии, и оценивать риски для будущих поколений. Именно широкий охват и высокая детализация делают полногеномное секвенирование таким привлекательным и перспективным методом диагностики.

Типы генетических изменений, которые полногеномное секвенирование может пропустить

Несмотря на свою широту, полногеномное секвенирование не является универсальным инструментом и имеет технические ограничения, из-за которых некоторые типы генетических изменений остаются незамеченными. Важно понимать, что не каждый аномальный процесс в клетке или организме обусловлен изменениями в последовательности ДНК, которые может обнаружить WGS. Далее мы рассмотрим основные категории таких изменений.

Крупные структурные перестройки хромосом

Крупные структурные перестройки, такие как сбалансированные транслокации или инверсии, часто пропускаются при стандартном полногеномном секвенировании. Сбалансированные транслокации — это обмен участками между двумя или более хромосомами без потери или приобретения генетического материала. Инверсии — это переворот участка хромосомы на 180 градусов. Проблема заключается в том, что короткие фрагменты ДНК, получаемые в процессе секвенирования, могут быть правильно выровнены относительно эталонного генома, не выявляя изменений в их первоначальном положении. Для обнаружения этих изменений требуются специализированные подходы к анализу данных, а зачастую и применение других методов, например, кариотипирования или флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), которые позволяют увидеть хромосомы целиком.

Кроме того, очень крупные делеции (потери) или дупликации (удвоения) генетического материала, хотя и являются несбалансированными структурными перестройками, также могут быть трудноразличимы для стандартных алгоритмов анализа полногеномного секвенирования, если они находятся в особо сложных или повторяющихся участках генома. Их обнаружение часто требует более специализированного программного обеспечения и визуализации, а золотым стандартом для многих из них остаются хромосомный микроматричный анализ (ХМА / Array CGH) или другие цитогенетические методы.

Сложные повторяющиеся участки ДНК и триплетные повторы

Длинные и сложные повторяющиеся участки ДНК, включая области с тандемными триплетными повторами, представляют значительную сложность для полногеномного секвенирования. Такие заболевания, как синдром ломкой Х-хромосомы, болезнь Хантингтона или миотоническая дистрофия, вызваны патологическим увеличением числа триплетных повторов (например, СGG, CAG) в определенных генах. Стандартная технология секвенирования использует короткие прочтения ДНК, которые затем собираются как пазл. В случае длинных повторяющихся участков, эти короткие прочтения не могут быть однозначно сопоставлены с конкретным местом в геноме, что делает точный подсчет числа повторов крайне затруднительным или невозможным. Для диагностики таких состояний необходимы специализированные методы, такие как фрагментный анализ или ПЦР с использованием специфических праймеров, направленных на подсчет этих повторов.

Низкоуровневый соматический мозаицизм

Соматический мозаицизм — это наличие генетически различных клеточных линий в одном организме, возникшее после оплодотворения. Низкоуровневый соматический мозаицизм означает, что мутация присутствует лишь в небольшой части клеток (например, менее 5-10%). Стандартное полногеномное секвенирование обычно выполняется на образце ДНК, выделенном из крови или слюны, представляющем собой смесь ДНК из миллионов клеток. Если мутация присутствует лишь в очень малом проценте этих клеток, она может быть "размыта" среди большого количества нормальной ДНК и не достичь порога обнаружения для большинства программных алгоритмов. Для выявления такого низкоуровневого мозаицизма требуются специализированные методы секвенирования с высокой глубиной прочтения и сложными биоинформатическими алгоритмами, а также, возможно, анализ ДНК из пораженных тканей.

Вариации митохондриальной ДНК

Митохондриальная ДНК (мтДНК) имеет собственную, отдельную от ядерного генома, структуру и способ наследования. Заболевания, связанные с мутациями в мтДНК, наследуются по материнской линии. Хотя полногеномное секвенирование теоретически может захватывать фрагменты мтДНК, его основное внимание — на ядерном геноме. Для точного и полного анализа вариаций в митохондриальной ДНК, особенно при выявлении гетероплазмии (наличие как мутировавшей, так и нормальной мтДНК в разных пропорциях), требуются специализированные протоколы секвенирования мтДНК с высоким покрытием и специфические алгоритмы анализа. Стандартное WGS часто не обеспечивает достаточной глубины прочтения для надежной количественной оценки гетероплазмии, которая является ключевым фактором во многих митохондриальных заболеваниях.

Эпигенетические модификации: за пределами последовательности

Полногеномное секвенирование сосредоточено исключительно на последовательности нуклеотидов в ДНК. Однако функции генов могут регулироваться не только изменениями в последовательности, но и эпигенетическими модификациями — химическими изменениями самой ДНК (например, метилирование) или ассоциированных с ней белков (гистонов), которые влияют на активность генов без изменения базовой последовательности. Эпигенетические модификации играют ключевую роль в развитии, дифференцировке клеток, а также в патогенезе многих заболеваний, включая рак. Полногеномное секвенирование не дает информации об этих изменениях. Для их изучения используются другие методы, такие как полногеномное бисульфитное секвенирование для метилирования ДНК, или ChIP-секвенирование для анализа модификаций гистонов.

Проблемы с покрытием и выравниванием сложных участков

Несмотря на стремление к полному покрытию, некоторые участки генома остаются "слепыми пятнами" для полногеномного секвенирования. Это происходит по нескольким причинам:

• Высокоповторяющиеся области: Участки, состоящие из множества повторяющихся последовательностей (например, центромеры, теломеры, сегментарные дупликации), крайне трудно секвенировать и точно выровнять относительно эталонного генома. Короткие прочтения ДНК не позволяют однозначно определить их местоположение.
• GC-богатые или GC-бедные области: Некоторые участки ДНК содержат аномально высокое или низкое содержание гуанина (G) и цитозина (C). Это может приводить к проблемам при амплификации ДНК и неравномерному покрытию во время секвенирования, что затрудняет обнаружение вариантов.
• Гаплотип-специфичные изменения: Некоторые сложные варианты, особенно в генах с псевдогенами (нефункциональными копиями гена), трудно различить с помощью стандартного короткочитающего секвенирования, так как прочтения могут быть ошибочно отнесены к псевдогену, а не к функциональному гену, или наоборот.

Интерпретация результатов: не все найденное — патология

Еще одно важное ограничение полногеномного секвенирования связано с интерпретацией полученных данных. WGS выявляет миллионы генетических вариантов у каждого человека. Однако подавляющее большинство из них являются доброкачественными полиморфизмами, не влияющими на здоровье. Отделение клинически значимых патогенных вариантов от безвредных — колоссальная задача, требующая глубоких знаний и сложных биоинформатических инструментов. Часто обнаруживаются "варианты неопределенного значения" (VUS), для которых на текущий момент недостаточно данных, чтобы однозначно отнести их к патогенным или доброкачественным. Это создает диагностическую неопределенность и может требовать дальнейших исследований, семейного анализа или функциональных тестов.

Кроме того, даже обнаружение патогенного варианта не всегда означает однозначное развитие заболевания. Некоторые генетические состояния имеют неполную пенетрантность (не у всех носителей варианта развивается болезнь) или вариабельную экспрессивность (степень проявления симптомов может сильно различаться). Влияние других генов, а также факторов окружающей среды и образа жизни, может модулировать клинический исход, что не может быть полностью предсказано одним лишь полногеномным секвенированием.

Когда одного полногеномного секвенирования недостаточно: дальнейшие шаги

Если результаты полногеномного секвенирования не дали объяснения клиническим симптомам пациента, это не всегда означает отсутствие генетической причины. В таких случаях врачам и пациентам следует рассмотреть возможность проведения дополнительных исследований.

Ниже приведена таблица с методами, которые могут дополнить или уточнить результаты полногеномного секвенирования, а также когда их стоит применять:

Важность комплексного подхода в медицинской генетике

Медицинская генетика — это область, где ни один метод не является панацеей. Полногеномное секвенирование, при всей своей революционности, — лишь один из инструментов в обширном арсенале диагностики. Наиболее эффективный подход к выявлению генетической причины заболевания всегда включает комплексную оценку. Это начинается с тщательного сбора анамнеза, подробного клинического осмотра, построения родословной, а затем уже выбора наиболее подходящих генетических тестов. В некоторых случаях первым шагом может быть кариотипирование или целенаправленный анализ одного гена, в других — сразу полногеномное секвенирование.

Важно помнить, что интерпретация генетических данных требует экспертных знаний и должна проводиться квалифицированным врачом-генетиком. Только он сможет сопоставить результаты анализа с клинической картиной, принять во внимание семейный анамнез и при необходимости назначить дополнительные исследования. Такой интегрированный, многосторонний подход позволяет максимально увеличить шансы на постановку точного диагноза и оказание эффективной помощи пациентам и их семьям.

Список литературы

1. Щагина О. А., Залетаев Д. В., Семенова О. М., Поляков А. В. Полногеномное секвенирование как диагностический инструмент в медицинской генетике: текущее состояние и перспективы // Медицинская генетика. — 2019. — Т. 18, № 1. — С. 3-12.
2. Ворсанова С. Г., Юров И. Ю., Демидова И. А. Медицинская генетика: национальное руководство. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. — 1000 с.
3. Green R. C. et al. ACMG Recommendations for Reporting of Secondary Findings in Clinical Exome and Genome Sequencing, 2021 Update: A Policy Statement of the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) // Genetics in Medicine. — 2021. — Vol. 23, No. 8. — P. 1395-1405.
4. Richards S. et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology // Genetics in Medicine. — 2015. — Vol. 17, No. 5. — P. 405-424.
5. Наследственные болезни: национальное руководство / Под ред. Н. П. Бочкова. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. — 936 с.