Механизм работы CRISPR/Cas9: как система находит и исправляет гены

Система CRISPR/Cas9 (КРИСПР/Кас9) произвела настоящую революцию в мире генетики, открыв беспрецедентные возможности для редактирования генов. Понимание механизма работы CRISPR/Cas9 позволяет осознать, как эта удивительная система находит и исправляет гены с высокой точностью. Технология, которая изначально была обнаружена как часть иммунной системы бактерий, сегодня дает надежду на лечение множества генетических заболеваний, изменяя наследственную информацию живых организмов. Именно детальное изучение того, как КРИСПР/Кас9 идентифицирует целевые последовательности ДНК и вносит в них изменения, раскрывает ее огромный потенциал.

Что такое CRISPR/Cas9 и как она возникла

Система CRISPR/Cas9, или система "коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами", представляет собой мощный инструмент для направленного редактирования генома. По своей сути, это молекулярные ножницы, способные точно разрезать ДНК в заранее определенном месте. Однако удивительнее всего то, что эта технология не была создана с нуля в лаборатории, а является адаптированной версией природной защитной системы, которую бактерии используют для борьбы с вирусами.

Микроорганизмы, такие как бактерии и археи, постоянно сталкиваются с угрозой вирусных инфекций. В процессе эволюции они развили уникальный механизм адаптивного иммунитета — систему КРИСПР/Кас9. Когда вирус вторгается в бактериальную клетку, бактерия способна "запомнить" его, вырезав небольшой фрагмент вирусной ДНК и вставив его в свой собственный геном в специальный участок CRISPR-локуса. Эти "запомненные" фрагменты, называемые спейсерами, служат образцами для распознавания вируса при последующих встречах. Если тот же вирус атакует снова, бактерия синтезирует короткие молекулы РНК (рибонуклеиновой кислоты) на основе этих спейсеров. Эти молекулы направляют фермент Cas9 (Криспр-ассоциированный белок 9) к соответствующей вирусной ДНК, которую Cas9 затем разрезает, нейтрализуя угрозу. Ученые смогли адаптировать этот природный механизм для целенаправленного изменения генов в любых организмах, от растений до человека.

Ключевые компоненты системы CRISPR/Cas9

Эффективность и точность системы CRISPR/Cas9 обусловлены слаженным взаимодействием нескольких основных компонентов. Понимание роли каждого из них помогает осознать, как система распознает и изменяет генетический материал.

Основные действующие "лица" в этой молекулярной машине включают:

• Белок Cas9 (Криспр-ассоциированный белок 9): Этот фермент является центральным элементом системы. Его основная функция — разрезать обе цепи молекулы ДНК. Cas9 действует как молекулярные ножницы, способные создавать двуцепочечный разрыв в целевом участке генома. Его активность зависит от точного наведения на цель, которое обеспечивается направляющей РНК.
• Направляющая РНК (гРНК): Это короткая молекула РНК, которая состоит из двух важных частей:
  • Спейсерная последовательность: Это та часть гРНК, которая комплементарна (точно соответствует) целевому участку ДНК, который необходимо изменить. Именно она определяет, куда именно будет направлен белок Cas9. Длина спейсерной последовательности обычно составляет около 20 нуклеотидов, что обеспечивает высокую специфичность.
  • Каркасная последовательность (tracrRNA): Эта часть РНК связывается с белком Cas9, позиционируя его для разрезания и обеспечивая стабильность всего комплекса.
  В современных генетических исследованиях эти две части часто объединяют в одну химерную молекулу, называемую одноцепочечной направляющей РНК (sgRNA), что упрощает работу с системой.
• PAM-последовательность (протоспейсер-соседний мотив): Это короткая (обычно 2-6 нуклеотидов) последовательность ДНК, которая должна находиться непосредственно рядом с целевым участком, комплементарным направляющей РНК. PAM-последовательность крайне важна для работы CRISPR/Cas9, поскольку белок Cas9 не может связываться с целевой ДНК и разрезать ее без наличия этого мотива. PAM действует как своеобразный "ключ", который открывает доступ для Cas9 к целевому участку. Наличие уникальной PAM-последовательности рядом с каждым потенциальным местом разрезания значительно повышает специфичность системы и предотвращает нежелательные разрезы в других местах генома.

Для лучшего понимания функций компонентов системы CRISPR/Cas9, обратите внимание на следующую таблицу:

Поиск и распознавание целевого гена: как система CRISPR/Cas9 находит нужный участок

Одним из наиболее впечатляющих аспектов работы системы CRISPR/Cas9 является ее способность с высокой точностью находить конкретный, заранее определенный участок среди миллиардов нуклеотидов в геноме. Этот процесс является многоступенчатым и крайне важным для успешного редактирования генов.

Все начинается с направляющей РНК (гРНК), которая содержит спейсерную последовательность, комплементарную целевому гену или участку ДНК, который мы хотим изменить. Комплекс белка Cas9 и гРНК постоянно сканирует геном клетки. Он скользит вдоль молекулы ДНК, проверяя каждую последовательность на наличие протоспейсер-соседнего мотива (PAM-последовательности). Как только комплекс обнаруживает такую PAM-последовательность, белок Cas9 делает паузу и начинает "раскручивать" двойную спираль ДНК в этом месте. Это позволяет спейсерной части направляющей РНК попытаться образовать водородные связи с комплементарной последовательностью в одной из цепей ДНК.

Если спейсерная последовательность гРНК идеально совпадает с целевым участком ДНК (комплементарное спаривание), происходит прочное связывание. PAM-последовательность действует как "сигнал тревоги" для Cas9, указывая, что это потенциально правильное место для разреза. Без этой последовательности, даже при идеальном совпадении с гРНК, Cas9 не сможет надежно связаться и произвести разрез. Такое двухступенчатое распознавание — сначала PAM, затем комплементарное спаривание гРНК — значительно повышает специфичность и снижает вероятность нежелательных разрезов ДНК в неправильных местах, что является частым опасением при использовании любой технологии редактирования генов.

Механизм разрезания ДНК: действие белка Cas9

После того как комплекс CRISPR/Cas9 успешно нашел и прочно связался с целевым участком ДНК благодаря направляющей РНК и PAM-последовательности, наступает ключевой этап — разрезание молекулы ДНК. Эту функцию выполняет белок Cas9.

Белок Cas9 содержит два нуклеазных домена, то есть специализированные участки, способные расщеплять нуклеиновые кислоты. Каждый из этих доменов предназначен для разрезания одной из двух цепей двойной спирали ДНК. После подтверждения точного совпадения с направляющей РНК, Cas9 активируется и одновременно производит двуцепочечный разрыв (ДЦР) в молекуле ДНК. Этот разрыв происходит на определенном расстоянии от PAM-последовательности, обычно в трех нуклеотидах выше по течению.

Создание двуцепочечного разрыва является крайне важным шагом, поскольку именно этот тип повреждения ДНК наиболее эффективно инициирует естественные клеточные механизмы репарации (восстановления) ДНК. Клетка воспринимает такой разрыв как серьезную угрозу для своей целостности и немедленно приступает к его устранению. Именно эту реакцию клетки и использует система CRISPR/Cas9 для внесения желаемых генетических изменений.

Исправление генов: процессы репарации после разрезания ДНК

После того как белок Cas9 сделал двуцепочечный разрыв в целевом участке ДНК, клетка активирует свои собственные механизмы для устранения этого повреждения. Именно на этом этапе открываются возможности для "исправления" или направленного изменения генов. Существует два основных пути репарации ДНК, которые могут быть задействованы:

• Негомологичное соединение концов (NHEJ):

  Это самый распространенный и быстрый механизм репарации двуцепочечных разрывов в эукариотических клетках. Клетка просто пытается сблизить и соединить разорванные концы ДНК. Однако этот процесс часто сопровождается ошибками: могут быть случайно вставлены (инсерции) или удалены (делеции) несколько нуклеотидов в месте разрыва. Эти небольшие случайные изменения могут привести к сдвигу рамки считывания гена, если разрыв произошел внутри кодирующей части, что обычно вызывает инактивацию гена. Это делает NHEJ полезным для "выключения" или "нокаута" определенных генов, чтобы изучить их функцию или остановить производство вредного белка. Например, если мутантный ген производит токсичный белок, его инактивация через NHEJ может быть терапевтически выгодной.

• Гомологично направленная репарация (HDR):

  Этот механизм более точен и используется клеткой, когда ей доступен шаблон для восстановления поврежденной ДНК, например, сестринская хроматида после репликации ДНК. HDR является идеальным путем для внесения точечных изменений, замены одного нуклеотида или вставки целых новых последовательностей ДНК в определенное место генома. Для этого ученые предоставляют клетке экзогенную молекулу ДНК (донорскую матрицу), которая содержит желаемые изменения и имеет фланкирующие последовательности (участки ДНК по обе стороны от модифицированного фрагмента), гомологичные (идентичные) областям вокруг двуцепочечного разрыва. Клетка использует эту донорскую матрицу как шаблон для точного восстановления разрыва, тем самым интегрируя желаемые генетические изменения. Этот путь репарации является менее эффективным, чем NHEJ, и активен в основном во время определенных фаз клеточного цикла, но именно он позволяет осуществлять прецизионное "исправление" генов.

Выбор пути репарации, инициированного после разреза ДНК системой CRISPR/Cas9, определяет тип генетического изменения. NHEJ чаще используется для отключения генов, в то время как HDR позволяет проводить целенаправленную коррекцию, вставку или замену специфических последовательностей ДНК, что делает его ключевым для лечения генетических заболеваний, связанных с конкретными мутациями.

Точность и перспективы технологии CRISPR/Cas9

С момента своего открытия система CRISPR/Cas9 стала одним из самых мощных и универсальных инструментов в молекулярной биологии и медицине. Ее способность точно находить и разрезать определенные участки ДНК открыла двери для беспрецедентных исследований и потенциальных терапевтических применений. Однако, как и любая передовая технология, она имеет свои особенности, требующие тщательного изучения.

Одним из ключевых аспектов, постоянно совершенствуемых исследователями, является точность CRISPR/Cas9. Хотя система очень специфична благодаря механизмам направляющей РНК и PAM-последовательности, существует небольшой риск так называемых "внецелевых эффектов" — разрезов ДНК в местах, которые не являются истинной мишенью. Эти внецелевые разрезы могут происходить, если где-то в геноме существует последовательность, достаточно похожая на целевую. Современные исследования активно направлены на разработку модификаций белка Cas9 и улучшенных дизайнов направляющей РНК, чтобы минимизировать эти эффекты и еще больше повысить специфичность системы CRISPR/Cas9. Например, создание "высокоточных" вариантов Cas9 с измененными активными центрами или использование двух "половинок" Cas9, каждая из которых направляется на свою последовательность ДНК, значительно снижает вероятность нежелательных разрезов.

Понимание механизма работы CRISPR/Cas9 лежит в основе ее широкого применения. Оно позволяет не только инактивировать или исправлять "ошибочные" гены, но и вставлять новые, функциональные генетические последовательности. Это открывает захватывающие перспективы в лечении множества заболеваний, от наследственных патологий, таких как муковисцидоз или серповидноклеточная анемия, до онкологических и инфекционных заболеваний. Постоянное совершенствование этой технологии делает ее одним из наиболее многообещающих направлений современной медицинской генетики.

Список литературы

1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., & Walter, P. (2014). Molecular Biology of the Cell (6th ed.). Garland Science.
2. Doudna, J. A., & Charpentier, E. (2014). The new frontier of genome engineering with CRISPR/Cas9. Science, 346(6213), 1258096.
3. Lodish, H., Berk, A., Kaiser, C. A., Krieger, M., Bretscher, A., Ploegh, H., Amon, A., & & Scott, M. P. (2016). Molecular Cell Biology (8th ed.). W. H. Freeman and Company.
4. Генетика: Учебник для ВУЗов / В. А. Куприянов, Г. И. Захаров, Е. А. Симонова. – М.: ФОРУМ: ИНФРА-М, 2018.
5. Молекулярная биология: Учебник / А. Н. Кузнецов, В. Г. Листопад. – Ростов н/Д: Феникс, 2012.