Диагностика моногенных заболеваний с помощью секвенирования по Сэнгеру

Диагностика моногенных заболеваний с помощью секвенирования по Сэнгеру — это высокоточный метод генетического анализа, который позволяет «прочитать» определённый участок ДНК для выявления конкретной мутации. Этот подход является «золотым стандартом» для подтверждения диагноза, когда у врача есть веские основания предполагать конкретное наследственное заболевание, вызванное изменением в одном гене. Понимание сути этого метода, его возможностей и ограничений помогает пациентам и их семьям осознанно подходить к процессу диагностики и принимать взвешенные решения о своём здоровье.

Что такое секвенирование по Сэнгеру и как оно работает

Секвенирование по Сэнгеру, также известное как метод терминации цепи, представляет собой целенаправленное исследование небольшого, заранее выбранного фрагмента генетического кода. Если представить всю нашу ДНК в виде огромной книги, то полногеномные методы читают всю книгу целиком, а метод Сэнгера позволяет с высочайшей точностью прочитать одну конкретную букву, слово или предложение, в котором подозревается «опечатка» — мутация.

Процесс проходит в несколько этапов:

• Выделение ДНК. Из биологического материала пациента (чаще всего из венозной крови, реже — из слюны или клеток слизистой оболочки щеки) в лаборатории выделяют ДНК.
• Амплификация. Нужный участок гена, который предстоит исследовать, многократно копируется с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Это необходимо, чтобы получить достаточное количество материала для анализа.
• Секвенирующая реакция. К скопированным фрагментам ДНК добавляют специальные реагенты, включая меченные флуоресцентными красителями «строительные блоки» ДНК (нуклеотиды). Эти меченые блоки останавливают дальнейшее копирование цепи в определённом месте. В результате образуется множество фрагментов ДНК разной длины, каждый из которых заканчивается определённым меченым нуклеотидом.
• Капиллярный электрофорез. Полученные фрагменты разделяются по длине с высочайшей точностью. Лазерный детектор считывает цвет метки на конце каждого фрагмента, определяя последовательность нуклеотидов один за другим.

В результате прибор выдаёт хроматограмму — график, на котором каждый пик определённого цвета соответствует одной из четырёх «букв» генетического кода (А, Т, Г, Ц). Врач-генетик сравнивает эту последовательность с эталонной (референсной) последовательностью здорового человека и обнаруживает любые отклонения.

Показания к проведению анализа: когда назначают этот метод

Секвенирование по Сэнгеру не является скрининговым тестом для всех. Это прицельный анализ, который назначается врачом-генетиком при наличии чётких показаний. Понимание этих показаний помогает осознать, почему в вашей ситуации был выбран именно этот, а не другой метод исследования.

Вот основные ситуации, в которых применяется метод Сэнгера:

• Подтверждение конкретного диагноза. Когда клиническая картина (симптомы, данные осмотра и других обследований) с высокой вероятностью указывает на конкретное моногенное заболевание. Например, при подозрении на муковисцидоз, фенилкетонурию, синдром Марфана, нейрофиброматоз 1-го типа или мышечную дистрофию Дюшенна.
• Семейный анамнез. Если в семье уже известен случай моногенного заболевания и выявлена конкретная мутация у одного из родственников. Метод Сэнгера позволяет прицельно проверить наличие именно этой мутации у других членов семьи.
• Подтверждение результатов других тестов. Иногда секвенирование нового поколения (NGS) выявляет потенциально значимый вариант в гене. Секвенирование по Сэнгеру используется как референсный метод для окончательного подтверждения или опровержения находки, сделанной с помощью NGS.
• Пренатальная диагностика. При высоком риске рождения ребёнка с известным в семье наследственным заболеванием.

Этапы диагностики: от консультации до получения результата

Весь процесс диагностики с помощью метода Сэнгера можно разделить на несколько последовательных и понятных шагов. Знание этой последовательности снижает тревогу и даёт понимание того, что происходит на каждом этапе.

1. Консультация врача-генетика. Это отправная точка. Врач собирает подробный семейный и личный анамнез, анализирует клинические данные, оценивает симптомы. На основе этой информации он определяет, есть ли основания подозревать конкретное моногенное заболевание и какой именно ген (или его участок) необходимо исследовать.
2. Сдача биологического материала. Чаще всего для анализа требуется венозная кровь. Процедура забора крови стандартная и не требует специальной подготовки, кроме общих рекомендаций (например, не принимать пищу за несколько часов до сдачи). Для многих пациентов важен вопрос комфорта: забор крови — быстрая и малоинвазивная процедура, вызывающая лишь кратковременный дискомфорт.
3. Лабораторный этап. Полученный образец отправляется в генетическую лабораторию. Здесь происходит выделение ДНК и само секвенирование по Сэнгеру. Этот процесс занимает время, так как требует высокой точности и соблюдения сложных протоколов.
4. Анализ и интерпретация результатов. Врач-лабораторный генетик анализирует полученные данные, сравнивает последовательность ДНК пациента с референсной и формирует заключение.
5. Повторная консультация врача-генетика. Это завершающий и самый важный этап. Врач объясняет результаты анализа простым и доступным языком, рассказывает, что они означают для пациента и его семьи, и даёт рекомендации по дальнейшим действиям, если это необходимо.

Расшифровка результатов: что означают заключения генетика

Получение заключения из лаборатории — волнительный момент. Важно понимать, что результаты генетического теста — это не просто «да» или «нет». Они требуют профессиональной интерпретации. В заключении может быть описан один из трёх основных вариантов.

Для вашего удобства мы свели возможные результаты и их значение в таблицу:

Преимущества и ограничения метода Сэнгера

Как и любой диагностический метод, секвенирование по Сэнгеру имеет свои сильные и слабые стороны. Их понимание позволяет оценить, почему именно этот анализ был выбран в конкретной клинической ситуации.

Ключевые особенности метода Сэнгера представлены в таблице:

Сравнение с секвенированием нового поколения (NGS): что выбрать

Сегодня наряду с методом Сэнгера активно используется секвенирование нового поколения (NGS). Это не взаимозаменяемые, а взаимодополняющие технологии. Выбор метода зависит от клинической задачи.

Основное отличие можно описать так: секвенирование по Сэнгеру — это снайперская винтовка, бьющая точно в цель, а NGS — это широкомасштабное сканирование, позволяющее осмотреть большую территорию.

Вот их ключевые различия:

Таким образом, выбор между этими методами делает врач на основании клинической картины. Если есть чёткая гипотеза, начинать с дорогого и масштабного NGS-исследования нецелесообразно. Если же диагноз неясен, то прицельное секвенирование по Сэнгеру может не найти причину, и тогда оправданно применение NGS.

Подготовка к исследованию и сроки выполнения

Одним из преимуществ данного анализа является отсутствие сложной подготовки для пациента. Специальной диеты или изменения образа жизни перед сдачей крови не требуется. Рекомендуется воздержаться от приёма пищи за 2–4 часа до процедуры, но это стандартное требование для большинства анализов крови. Важно сообщить врачу обо всех принимаемых лекарственных препаратах, хотя они крайне редко влияют на результат генетического теста.

Сроки выполнения анализа могут варьироваться в зависимости от загруженности лаборатории и сложности исследования конкретного гена. В среднем получение результата занимает от 10 рабочих дней до 3–4 недель. Важно понимать, что генетический анализ — это сложный многоэтапный процесс и спешка здесь неуместна, так как точность является главным приоритетом.

Список литературы

1. Гинтер Е. К. Медицинская генетика: учебник. — М.: Медицина, 2003. — 448 с.
2. Бочков Н. П. Клиническая генетика: учебник. — 4-е изд., доп. и перераб. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. — 592 с.
3. Nussbaum R. L., McInnes R. R., Willard H. F. Thompson & Thompson Genetics in Medicine. 8th Edition. — Elsevier, 2016. — 544 p.
4. Richards S., Aziz N., Bale S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology // Genetics in Medicine. — 2015. — Vol. 17(5). — P. 405–424.
5. Клинические рекомендации «Муковисцидоз». Министерство здравоохранения Российской Федерации, 2021. (Как пример клинических рекомендаций, где секвенирование является стандартом диагностики).