Другие методы редактирования генома: сравнение CRISPR с ZFN и TALEN

В мире медицинской генетики постоянно происходят прорывы, и методы редактирования генома стоят в авангарде этих изменений. Хотя система CRISPR-Cas9 часто упоминается как самая известная и революционная технология, важно понимать, что она не возникла из ниоткуда. Ей предшествовали и существуют параллельно другие, не менее значимые подходы, такие как нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN) и TALEN-нуклеазы. Эти методы сыграли ключевую роль в становлении технологий целенаправленного изменения ДНК и продолжают оставаться важными инструментами в арсенале генетиков. Эта страница поможет разобраться в нюансах каждого из них, их механизмах действия, преимуществах и ограничениях, а также сравнить их с более современной системой CRISPR, давая полное представление об эволюции и разнообразии подходов к редактированию генома.

Эволюция редактирования генома: от первых шагов до CRISPR-Cas9

Возможность точечного изменения генетического кода живых организмов всегда была мечтой ученых, открывающей невероятные перспективы для понимания болезней и разработки новых методов лечения. Долгое время манипуляции с ДНК были неспецифичными и малоэффективными. Однако научные открытия в области ферментов, способных разрезать ДНК в определенных местах, проложили путь к программируемому редактированию генома. Именно эти ранние исследования легли в основу таких технологий, как нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN) и транскрипционно-активатор-подобные эффекторные нуклеазы (TALEN), которые стали настоящим прорывом и заложили фундамент для последующей, более совершенной системы CRISPR-Cas9. Понимание этого эволюционного пути помогает осознать, почему каждый из методов был важен и какие задачи он решал на своем этапе развития.

Нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN): первый прорыв в редактировании ДНК

Нуклеазы с цинковыми пальцами, или ZFN, представляют собой первую широко используемую платформу для целенаправленного редактирования генома, которая позволила ученым с высокой точностью изменять ДНК в живых клетках. Суть технологии нуклеаз с цинковыми пальцами заключается в создании искусственных ферментов, способных разрезать ДНК только в заранее определенных участках. Эти ферменты состоят из двух основных компонентов: ДНК-связывающего домена, который представляет собой белки с так называемыми цинковыми пальцами, и домена, расщепляющего ДНК, который обычно является частью фермента нуклеазы FokI.

Каждый цинковый палец в ДНК-связывающем домене специфически распознает определенный набор из трех нуклеотидов. Объединяя несколько таких цинковых пальцев вместе, можно создать белок, который будет распознавать более длинную и, следовательно, более уникальную последовательность ДНК. Когда два таких гибридных белка (каждый со своим ДНК-связывающим доменом и одной половиной нуклеазы FokI) связываются с ДНК по обе стороны от целевого участка, они димеризуются, активируя полную нуклеазную активность FokI. Это приводит к двуцепочечному разрыву в ДНК, что является ключевым событием для последующего редактирования генома. Клетка стремится восстановить этот разрыв, используя свои собственные механизмы репарации, такие как негомологичное соединение концов (NHEJ), которое часто приводит к мутациям (например, вставкам или делециям) и инактивации гена, или гомологичную рекомбинацию (HDR), которая позволяет вставить в разрыв новую последовательность ДНК по шаблону.

Хотя нуклеазы с цинковыми пальцами были революционными для своего времени, их дизайн и сборка являются достаточно трудоемкими и дорогостоящими процессами. Каждый новый целевой участок ДНК требует создания уникального белкового модуля, что значительно усложняет и замедляет работу, особенно при необходимости редактирования нескольких генов одновременно. Тем не менее, именно благодаря ZFN был впервые продемонстрирован потенциал программируемых нуклеаз для лечения генетических заболеваний, например, в доклинических исследованиях по борьбе с ВИЧ.

TALEN-нуклеазы (TALEN): точность и гибкость на новом уровне

TALEN-нуклеазы (транскрипционно-активатор-подобные эффекторные нуклеазы) стали следующим важным шагом в развитии технологий редактирования генома после нуклеаз с цинковыми пальцами. Они представляют собой еще один тип искусственно сконструированных ферментов, способных к целенаправленному разрезанию ДНК. Принцип их работы схож с ZFN в том, что они также используют ДНК-связывающий домен и домен нуклеазы FokI, но отличаются по своей структуре и способу распознавания ДНК.

ДНК-связывающие домены TALEN-нуклеаз основаны на белках, обнаруживаемых у растительных патогенов рода Xanthomonas. Эти белки известны своей способностью очень специфично связываться с отдельными нуклеотидами ДНК. Ключевая особенность TALEN заключается в модульной структуре их ДНК-связывающего домена: каждый модуль TALEN-нуклеаз состоит из повторяющихся последовательностей длиной 33-34 аминокислоты, которые распознают всего один конкретный нуклеотид (аденин, гуанин, цитозин или тимин). Это значительно упрощает дизайн TALEN-нуклеаз по сравнению с ZFN, поскольку для создания нового специфичного белка достаточно просто собрать нужные модули в правильном порядке, чтобы они соответствовали целевой последовательности ДНК. Например, модуль, распознающий аденин, всегда будет связываться с аденином, что делает процесс предсказуемым и относительно легким для масштабирования.

Как и в случае с нуклеазами с цинковыми пальцами, для активации расщепляющей активности FokI необходима димеризация двух TALEN-нуклеазных белков, каждый из которых связывается с противоположными нитями ДНК в целевом участке. Образовавшийся двуцепочечный разрыв затем может быть использован для инактивации гена или для введения новой генетической информации через механизмы репарации клетки. TALEN-нуклеазы обладают высокой специфичностью и низкой внецелевой активностью, что делает их привлекательным инструментом для исследований и потенциальных терапевтических применений. Их модульная природа значительно упростила процесс создания инструментов для редактирования генома по сравнению с ZFN, что способствовало их более широкому распространению в научных лабораториях.

CRISPR-Cas9: революция в редактировании генома

Система CRISPR-Cas9 (от англ. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – регулярно расположенные короткие палиндромные повторы, объединенные в группы) стала настоящей революцией в области редактирования генома благодаря своей простоте, высокой эффективности и беспрецедентной гибкости. В отличие от своих предшественников, нуклеаз с цинковыми пальцами и TALEN-нуклеаз, которые для нацеливания на ДНК использовали сложные белковые модули, CRISPR-Cas9 использует молекулу РНК в качестве наводящего элемента. Это принципиальное отличие существенно упростило и удешевило процесс создания инструментов для редактирования генома, сделав его доступным для значительно более широкого круга исследователей.

Основными компонентами системы CRISPR-Cas9 являются нуклеаза Cas9, которая является "молекулярными ножницами", и направляющая РНК (гРНК). Направляющая РНК представляет собой короткую молекулу, содержащую последовательность, комплементарную целевому участку ДНК, который необходимо отредактировать. Cas9 связывается с этой направляющей РНК, и весь комплекс затем перемещается по геному, пока направляющая РНК не найдет свою комплементарную последовательность в ДНК. При успешном связывании Cas9 разрезает обе нити ДНК, создавая двуцепочечный разрыв. Как и в случае с ZFN и TALEN-нуклеазами, клетка затем пытается восстановить этот разрыв, что может быть использовано для инактивации гена или для вставки новых генетических последовательностей.

Преимущества системы CRISPR-Cas9 перед ZFN и TALEN-нуклеазами очевидны: легкость дизайна гРНК по сравнению с конструированием специфических белков, возможность одновременного редактирования нескольких генов (мультиплексирование), а также высокая скорость и низкая стоимость. Эти факторы привели к тому, что CRISPR-Cas9 быстро вытеснила ZFN и TALEN-нуклеазы из большинства исследовательских применений, став стандартом в области редактирования генома. Однако, несмотря на доминирование CRISPR, понимание механизмов и ограничений ZFN и TALEN-нуклеаз остается важным для полного представления об истории и разнообразии подходов к манипуляциям с ДНК.

Ключевые отличия: CRISPR, ZFN и TALEN в деталях

Для лучшего понимания нюансов каждой из технологий редактирования генома — нуклеаз с цинковыми пальцами (ZFN), TALEN-нуклеаз и системы CRISPR-Cas9 — важно рассмотреть их основные характеристики в сравнении. Несмотря на общую цель (создание двуцепочечного разрыва ДНК в целевом месте), эти методы значительно различаются по механизмам действия, сложности дизайна, стоимости и областям применения. Представленная ниже таблица поможет наглядно сравнить эти ключевые аспекты.

Преимущества и недостатки каждого метода редактирования генома

Выбор конкретного метода редактирования генома зависит от множества факторов, включая специфические цели исследования, доступное оборудование и требуемый уровень точности. Каждый из рассмотренных методов — нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN), TALEN-нуклеазы и система CRISPR-Cas9 — имеет свои уникальные преимущества и ограничения, которые определяют их нишу применения.

Преимущества ZFN:

• Пионерская роль: ZFN были первыми инструментами, показавшими возможность программируемого редактирования генома в эукариотических клетках. Это открыло дорогу для всех последующих разработок.
• Надежность: Несмотря на сложность дизайна, хорошо спроектированные ZFN могут быть очень эффективными и специфичными, особенно в модельных системах, где их использование хорошо отработано.

Недостатки ZFN:

• Сложность и стоимость дизайна: Создание уникальных белковых доменов для каждого целевого участка является трудоемким, дорогостоящим и времязатратным процессом, требующим специализированных знаний в белковой инженерии.
• Ограниченное мультиплексирование: Редактирование нескольких генов одновременно с помощью ZFN крайне сложно.
• Иммуногенность: При использовании в терапевтических целях белковые компоненты ZFN могут вызывать нежелательный иммунный ответ.

Преимущества TALEN-нуклеаз:

• Высокая специфичность: Модульная природа TALEN обеспечивает очень точное распознавание целевых последовательностей ДНК, что снижает риск нецелевых мутаций.
• Относительная простота дизайна: По сравнению с ZFN, модульный подход к сборке TALEN значительно упрощает их конструирование, делая их более доступными для исследователей.
• Низкая внецелевая активность: TALEN-нуклеазы часто демонстрируют меньшую внецелевую активность по сравнению с ранними версиями CRISPR, что важно для минимизации нежелательных изменений в геноме.

Недостатки TALEN-нуклеаз:

• Размер: Белковые комплексы TALEN достаточно большие, что может создавать проблемы при доставке в клетки и ткани, особенно с использованием вирусных векторов.
• Трудоемкость: Несмотря на модульность, сборка и тестирование TALEN все еще требует больше усилий и времени, чем дизайн CRISPR-систем.

Преимущества CRISPR-Cas9:

• Простота и скорость дизайна: Главное преимущество CRISPR-Cas9 заключается в использовании РНК для нацеливания, что делает дизайн системы для новой целевой последовательности чрезвычайно быстрым и простым (достаточно синтезировать короткую молекулу РНК).
• Низкая стоимость: Простота дизайна и доступность реагентов делают CRISPR-Cas9 самым экономичным методом редактирования генома.
• Высокая эффективность и мультиплексирование: CRISPR-Cas9 позволяет эффективно редактировать множество генов одновременно, что неоценимо для комплексных исследований и моделирования болезней.
• Универсальность: Может быть адаптирована для множества задач, помимо разрезания ДНК, включая активацию/репрессию генов (CRISPRa/i), изменение эпигенетических меток и визуализацию ДНК.

Недостатки CRISPR-Cas9:

• Внецелевая активность: Хотя современные модификации CRISPR-систем значительно улучшили специфичность, риск нецелевых разрезов полностью не устранен и требует тщательной проверки.
• PAM-последовательность: Для работы большинства Cas-нуклеаз требуется наличие специфической последовательности протоспейсер-смежного мотива (PAM) рядом с целевым участком, что может ограничивать выбор целей.
• Размер Cas-белка: Некоторые Cas-белки (например, Cas9 из Streptococcus pyogenes) достаточно велики, что может создавать трудности при доставке с использованием некоторых аденоассоциированных вирусных векторов (AAV), хотя новые, более компактные варианты Cas-белков (например, Cas12a) решают эту проблему.

В целом, несмотря на доминирование CRISPR-Cas9 в большинстве областей, ZFN и TALEN-нуклеазы продолжают использоваться в некоторых специфических нишах, например, когда требуется максимально низкая внецелевая активность или когда уже существуют отработанные и проверенные ZFN или TALEN для конкретной задачи.

Области применения и перспективы развития методов редактирования генома

Методы редактирования генома, включая нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN), TALEN-нуклеазы и особенно система CRISPR-Cas9, открыли беспрецедентные возможности для фундаментальных научных исследований и имеют огромный потенциал для практического применения. Эти технологии уже трансформируют подходы к изучению биологии и развитию медицины, биотехнологии и сельского хозяйства.

В медицинских исследованиях и терапии:

• Моделирование заболеваний: Редактирование генома позволяет создавать клеточные линии и животные модели (например, мышей, крыс, свиней) с конкретными генетическими изменениями, имитирующими человеческие болезни. Это помогает ученым лучше понять патогенез заболеваний и тестировать новые терапевтические стратегии.
• Генная терапия: Возможность точечной коррекции мутаций, вызывающих генетические заболевания, является одним из наиболее перспективных направлений. Например, уже ведутся клинические испытания CRISPR-Cas9 для лечения таких болезней, как серповидноклеточная анемия, бета-талассемия, а также некоторые формы наследственной слепоты. ZFN и TALEN также используются в исследованиях генной терапии, например, для создания устойчивости к ВИЧ.
• Противораковая иммунотерапия: Редактирование генома применяется для модификации иммунных клеток пациента (например, Т-клеток) с целью повышения их способности распознавать и уничтожать раковые клетки (например, в CAR-T клеточной терапии).
• Разработка новых лекарств: Создание генетически модифицированных клеточных систем позволяет быстрее и эффективнее скринировать потенциальные лекарственные соединения, выявляя те, которые могут влиять на конкретные генетические пути.

В биотехнологии и сельском хозяйстве:

• Улучшение сельскохозяйственных культур: Методы редактирования генома используются для создания растений с повышенной устойчивостью к вредителям, болезням, засухе, а также с улучшенными питательными свойствами и урожайностью.
• Разведение животных: Возможно модифицировать геном сельскохозяйственных животных для повышения устойчивости к заболеваниям, увеличения продуктивности или улучшения качества продукции (например, мяса, молока).
• Производство биофармацевтических препаратов: Генетически модифицированные микроорганизмы или животные могут быть использованы для эффективного производства инсулина, гормонов роста, вакцин и других ценных белков.

Перспективы развития методов редактирования генома включают разработку еще более точных, эффективных и безопасных систем, которые минимизируют внецелевые эффекты и упрощают доставку. Исследования сосредоточены на поиске новых Cas-белков с различными свойствами, разработке систем без двуцепочечных разрывов (например, базовые редакторы и прайм-редакторы), которые могут напрямую изменять отдельные нуклеотиды, а также на совершенствовании методов доставки компонентов редактирования в целевые клетки и ткани человека. Хотя эти технологии еще находятся на относительно ранних стадиях клинического применения, их потенциал для преобразования медицины и других областей является поистине колоссальным.

Безопасность и этические аспекты редактирования генома

Развитие технологий редактирования генома, таких как нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN), TALEN-нуклеазы и CRISPR-Cas9, неизбежно поднимает важные вопросы безопасности и этики. Несмотря на огромный потенциал этих методов, их применение требует самого тщательного подхода и всестороннего рассмотрения.

Вопросы безопасности:

• Внецелевые мутации: Основная проблема безопасности связана с возможностью возникновения внецелевых разрезов или изменений ДНК в непредусмотренных местах генома. Такие нежелательные мутации могут привести к непредсказуемым последствиям, включая активацию онкогенов или инактивацию супрессоров опухолей, что потенциально может спровоцировать развитие рака или другие нарушения клеточных функций. Хотя современные версии CRISPR-систем и улучшенные протоколы значительно снижают риск внецелевых эффектов, полное их исключение остается одной из главных задач исследований.
• Мозаицизм: При редактировании на ранних стадиях развития организма или при неполной эффективности метода, могут возникать клетки с отредактированным геномом и клетки с исходным геномом. Это явление, называемое мозаицизмом, может влиять на эффективность терапии и усложнять оценку результатов.
• Доставка и иммуногенность: Методы доставки компонентов редактирования (например, вирусные векторы) могут вызывать иммунный ответ организма, что ограничивает их повторное применение или приводит к нежелательным побочным эффектам. Белковые компоненты ZFN, TALEN и CRISPR также потенциально могут быть иммуногенными.

Этические аспекты:

• Редактирование соматических и зародышевых клеток: Существует фундаментальное различие между редактированием соматических (неполовых) клеток, изменения в которых не передаются по наследству, и редактированием зародышевых клеток (половых клеток или эмбрионов), изменения в которых наследуются. Редактирование соматических клеток для лечения заболеваний (например, серповидноклеточной анемии) в целом считается этически приемлемым и является предметом активных клинических испытаний. Однако редактирование зародышевой линии, которое может изменить геном будущих поколений, вызывает серьезные этические опасения из-за непредсказуемых долгосрочных последствий, рисков для человеческого наследия и потенциального использования для "дизайнерских детей". Большинство стран и международных организаций призывают к мораторию или строгому регулированию редактирования зародышевой линии человека.
• Социальное равенство и доступность: Высокая стоимость передовых генетических технологий может привести к тому, что они будут доступны только ограниченному кругу лиц, что усугубит социальное неравенство в доступе к медицине.
• Границы применения: Возникают вопросы о том, до какой степени допустимо "улучшать" человеческие качества, выходя за рамки лечения заболеваний. Эти дебаты требуют широкого общественного обсуждения и международного консенсуса.

Ученые, регуляторы и общественность активно обсуждают эти вопросы, разрабатывая этические руководства и законодательные нормы. Ответственное использование этих мощных инструментов требует постоянного мониторинга, прозрачности исследований и глубокого понимания как потенциальных выгод, так и возможных рисков для человека и общества.

Список литературы

1. Gaj T., Gersbach C.A., Barbas C.F. 3rd. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering // Trends Biotechnol. — 2013. — Т. 31, № 7. — С. 397-405.
2. Joung J.K., Sander J.D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing // Nat Rev Mol Cell Biol. — 2013. — Т. 14, № 1. — С. 40-48.
3. Carroll D. Genome engineering with zinc-finger nucleases // Genetics. — 2011. — Т. 188, № 1. — С. 1-12.
4. Doudna J.A., Charpentier E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9 // Science. — 2014. — Т. 346, № 6213. — С. 1258096.
5. Лысов Ю.П. Редактирование генома человека: обзор методов и перспектив // Молекулярная биология. — 2016. — Т. 50, № 1. — С. 3-17.
6. Гинтер Е.К. Медицинская генетика. Учебник. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. — С. 250-265.