Принцип работы ПЦР: как происходит многократное копирование участка ДНК

Принцип работы полимеразной цепной реакции (ПЦР) заключается в многократном избирательном копировании (амплификации) определённого участка ДНК в лабораторных условиях. Этот метод позволяет из минимального количества исходного генетического материала, буквально из одной-единственной молекулы, получить миллионы и миллиарды идентичных копий. Благодаря такой высокой чувствительности и специфичности ПЦР стала одним из ключевых инструментов в медицинской генетике, диагностике инфекционных заболеваний, криминалистике и многих других областях науки и медицины.

Что такое полимеразная цепная реакция и зачем она нужна

Полимеразная цепная реакция — это метод, который имитирует естественный процесс удвоения (репликации) ДНК, но делает это в пробирке и в ускоренном темпе. Представьте, что у вас есть огромная библиотека, в которой нужно найти одно-единственное предложение и сделать с него миллион копий. Найти его вручную практически невозможно. ПЦР выступает в роли своего рода «молекулярного ксерокса», который находит именно этот уникальный фрагмент и многократно его размножает, делая его видимым для последующего анализа.

Основная цель метода — увеличить концентрацию конкретного участка ДНК до уровня, достаточного для детекции. Это необходимо, когда исходного материала очень мало. Например, для обнаружения вируса в крови на ранней стадии инфекции, выявления генетической мутации, ответственной за наследственное заболевание, или для идентификации личности по микроскопическому биологическому следу.

Ключевые компоненты для запуска реакции

Для успешного проведения полимеразной цепной реакции требуется точная смесь нескольких ключевых компонентов, каждый из которых выполняет свою уникальную функцию. Отсутствие или неправильная концентрация хотя бы одного из них приведёт к тому, что копирование ДНК не произойдёт. Ниже в таблице представлены основные участники этого процесса.

Три основных этапа цикла ПЦР

Процесс многократного копирования ДНК происходит циклически, при этом каждый цикл состоит из трёх последовательных этапов, различающихся по температуре. Все эти температурные смены происходят в специальном приборе — термоциклере, или амплификаторе.

• Денатурация (94–96 °C). На первом этапе реакционную смесь нагревают до высокой температуры. При этом водородные связи, удерживающие две цепи ДНК вместе, разрываются, и двойная спираль «расплетается» на две отдельные нити. Каждая из этих нитей теперь может служить шаблоном для синтеза новой цепи.
• Отжиг праймеров (50–65 °C). Далее температуру резко снижают. Это позволяет праймерам найти и связаться со своими комплементарными участками на одноцепочечных матрицах ДНК. Температура отжига подбирается очень точно, чтобы праймеры связались только с нужной последовательностью, что и обеспечивает высокую специфичность метода.
• Элонгация, или синтез (72 °C). Температуру снова повышают до оптимальной для работы ДНК-полимеразы (около 72 °C). Фермент присоединяется к комплексу «праймер-матрица» и начинает достраивать новую, комплементарную цепь ДНК, используя свободные нуклеотиды из раствора. В результате на каждой из исходных нитей ДНК синтезируется новая, и из одной двойной спирали получаются две.

Эти три шага составляют один цикл полимеразной цепной реакции. По его завершении количество целевых фрагментов ДНК удваивается.

Экспоненциальный рост: как одна молекула ДНК превращается в миллиарды

Ключевая особенность метода ПЦР — это экспоненциальный характер накопления продукта. После каждого цикла количество копий целевого фрагмента ДНК удваивается. Этот процесс повторяется многократно, обычно 25–35 раз.

Давайте посмотрим, как это происходит:

• После 1-го цикла: 2 копии
• После 2-го цикла: 4 копии
• После 3-го цикла: 8 копий
• После 4-го цикла: 16 копий

Уже после 30 таких циклов из одной исходной молекулы ДНК образуется более миллиарда (2 в 30-й степени) идентичных копий. Такого количества генетического материала уже более чем достаточно для его надёжного обнаружения и дальнейшего анализа, например, с помощью электрофореза или флуоресцентной детекции в ПЦР в реальном времени.

Что обеспечивает высокую точность и специфичность полимеразной цепной реакции

Высокая точность и специфичность ПЦР-диагностики, которая позволяет находить уникальный генетический фрагмент в сложном биологическом образце, достигается за счёт нескольких факторов. Главный из них — это уникальность праймеров. Они синтезируются таким образом, чтобы идеально подходить только к тому участку ДНК, который является целью исследования (например, гену вируса или мутантному гену человека). Если в образце нет искомого фрагмента, праймерам просто не с чем будет связываться и реакция амплификации не начнётся.

Вторым важным фактором является строгий контроль температурных режимов в термоциклере. Температура отжига подбирается таким образом, чтобы обеспечить прочное связывание праймеров только с полностью комплементарной им последовательностью. Любые неспецифические, частичные связывания при такой температуре будут нестойкими и не приведут к запуску синтеза. Таким образом, сочетание уникально подобранных праймеров и точного температурного контроля гарантирует, что копироваться будет только нужный участок ДНК, исключая ложноположительные результаты.

Список литературы

1. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки: в 3 т. — М.: Мир, 1994.
2. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. — М.: Мир, 2002. — 589 с.
3. Ребриков Д. В., Саматов Г. А., Трофимов Д. Ю. ПЦР «в реальном времени». — М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. — 223 с.
4. Клиническая лабораторная диагностика: национальное руководство: в 2 т. / под ред. В. В. Долгова, В. В. Меньшикова. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012.
5. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия. — Новосибирск: Сибирское университетское издательство, 2004. — 496 с.