Цитогенетические методы исследования: полное руководство по анализу хромосом

Цитогенетические методы исследования представляют собой комплекс лабораторных подходов, предназначенных для изучения хромосом человека с целью выявления их структурных или количественных изменений. Хромосомы являются носителями генетической информации в виде молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и определяют все аспекты развития и функционирования организма. Любые нарушения в их строении или числе приводят к развитию различных генетических заболеваний и синдромов.

Эти методы диагностики позволяют обнаружить хромосомные аномалии, лежащие в основе многих врожденных синдромов, таких как синдром Дауна (трисомия 21), синдром Эдвардса (трисомия 18) и синдром Патау (трисомия 13), а также микроделеционные и микродупликационные синдромы, которые могут проявляться пороками развития и задержкой психомоторного развития. Цитогенетические исследования также незаменимы при анализе причин бесплодия, привычного невынашивания беременности и в диагностике ряда онкологических заболеваний, связанных с приобретенными хромосомными перестройками.

Современная цитогенетика располагает широким спектром аналитических техник, начиная от классического кариотипирования и заканчивая высокоточными молекулярно-цитогенетическими методами. К ним относятся флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), сравнительная геномная гибридизация (CGH и aCGH — сравнительная геномная гибридизация на микроматрицах) и количественная флуоресцентная полимеразная цепная реакция (QF-PCR). Каждый из этих подходов имеет свои уникальные диагностические возможности и ограничения, позволяя получать детальную и специфическую информацию о генетическом материале пациента.

Основы генетики: что такое хромосомы и их роль в здоровье человека

Хромосомы представляют собой уникальные структуры, расположенные внутри ядра каждой клетки человека, за исключением зрелых эритроцитов. Они являются ключевыми носителями наследственной информации, упакованной в молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), и играют фундаментальную роль в передаче генетических признаков от родителей к потомству, а также в обеспечении нормального развития и функционирования организма.

Строение хромосом: от ДНК до компактной структуры

Каждая хромосома состоит из длинной, плотно упакованной молекулы ДНК, которая наматывается вокруг специализированных белков, называемых гистонами. Этот комплекс ДНК и белков формирует хроматин, который затем конденсируется, образуя видимую под микроскопом структуру хромосомы во время деления клетки. Такая сложная организация позволяет компактно разместить огромный объем генетической информации в ограниченном пространстве клеточного ядра.

Типичная метафазная хромосома, которую исследуют цитогенетические методы, состоит из двух идентичных сестринских хроматид, соединенных в центральной области, называемой центромерой. Центромера имеет критическое значение для правильного расхождения хромосом во время клеточного деления. Концевые участки хромосом называются теломерами. Теломеры защищают хромосомы от деградации и слияния, а также участвуют в регуляции клеточного старения.

Кариотип человека: число и типы хромосом

Совокупность всех хромосом в клетке организма называется кариотипом. Нормальный кариотип человека включает 46 хромосом, которые организованы в 23 пары. Из них 22 пары являются аутосомами, или неполовыми хромосомами, одинаковыми у мужчин и женщин, и отвечают за развитие всех признаков организма, кроме половых. Одна пара является половыми хромосомами, определяющими пол человека:

• Женщины имеют две X-хромосомы (XX).
• Мужчины имеют одну X-хромосому и одну Y-хромосому (XY).

Каждая пара аутосом и половых хромосом содержит гомологичные хромосомы — одну, унаследованную от матери, и одну от отца.

Гены и хромосомы: кодирование наследственной информации

Гены представляют собой специфические участки молекулы ДНК, расположенные вдоль хромосом. Каждый ген содержит уникальный код для синтеза определенного белка или регулирующей РНК, которые выполняют множество функций в организме. Белки являются строительными блоками клеток, ферментами, гормонами и обеспечивают практически все биохимические процессы, необходимые для жизни.

Сотни тысяч генов, расположенных на 46 хромосомах, определяют индивидуальные особенности человека, такие как цвет глаз, волос, группа крови, а также предрасположенность к определенным заболеваниям. Правильная работа каждого гена и целостность хромосомы, на которой он находится, является основой для здорового развития и функционирования всех систем организма.

Роль хромосом в здоровье и развитии человека

Хромосомы играют центральную роль во всех аспектах жизни человека, от момента зачатия до старости. Они не только обеспечивают передачу наследственных признаков, но и регулируют сложнейшие процессы роста, дифференцировки клеток, метаболизма и адаптации к окружающей среде.

Любые изменения в числе или структуре хромосом, даже самые незначительные, могут серьезно нарушить генетический баланс и привести к развитию широкого спектра патологий. К ним относятся врожденные пороки развития, задержка психомоторного развития, нарушения репродуктивной функции (бесплодие, невынашивание беременности) и повышение риска онкологических заболеваний. Именно поэтому цитогенетические исследования, направленные на анализ хромосом, являются незаменимым инструментом в современной медицинской диагностике.

Цитогенетические методы исследования: определение, история и значение в современной медицине

Цитогенетические методы исследования являются специализированным направлением лабораторной диагностики, фокусирующимся на изучении структуры и числа хромосом с целью выявления патологических изменений. Эти методы позволяют обнаружить как крупные нарушения, видимые под микроскопом, так и более тонкие перестройки, неразличимые классическими методами, но имеющие существенное клиническое значение для здоровья человека и его потомства.

Краткая история развития цитогенетики

Эволюция цитогенетики как науки отражает прогресс в нашем понимании наследственности и развитии технологий для исследования генетического материала. Путь от первых наблюдений до высокоточных молекулярных методов был долог и значим.

Основные этапы развития цитогенетических методов включают:

• Середина XIX века: Первые описания хромосом как структур, участвующих в клеточном делении, сделанные Вальтером Флеммингом.
• 1956 год: Прорывное открытие Джо Тио и Альберта Левана, установивших точное число хромосом человека — 46. Это стало отправной точкой для современной клинической цитогенетики.
• Конец 1960-х – начало 1970-х годов: Разработка и внедрение методов дифференциального окрашивания хромосом (полосового окрашивания), таких как Q-, G- и R-окрашивание. Эти техники позволили идентифицировать каждую пару хромосом и выявлять структурные перестройки (например, делеции, дупликации, транслокации) по их уникальному рисунку полос.
• 1980-е годы: Появление метода флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Эта молекулярно-цитогенетическая техника совершила революцию, позволив прицельно исследовать конкретные участки хромосом с использованием флуоресцентно меченых зондов, значительно повысив разрешающую способность диагностики микроделеций и микродупликаций.
• 1990-е – 2000-е годы: Развитие сравнительной геномной гибридизации (CGH) и её более высокопроизводительной версии — сравнительной геномной гибридизации на микроматрицах (aCGH). Эти методы позволяют сканировать весь геном на предмет несбалансированных хромосомных аномалий с беспрецедентной точностью и скоростью.
• Начало XXI века и настоящее время: Дальнейшее усовершенствование существующих методов и появление новых, таких как количественная флуоресцентная полимеразная цепная реакция (QF-PCR) и мультиплексная лигазная проба in situ (MLPA), обеспечивающих ещё большую чувствительность и специфичность для различных диагностических задач.

Значение цитогенетических исследований в современной медицине

Цитогенетические методы занимают центральное место в современной диагностике, профилактике и лечении многих заболеваний. Их значимость определяется уникальной способностью выявлять причины патологий на хромосомном уровне, что позволяет принимать обоснованные клинические решения.

Основные области применения и значение цитогенетических исследований:

• Диагностика врождённых и наследственных синдромов: Цитогенетический анализ является "золотым стандартом" для подтверждения диагнозов, связанных с числовыми аномалиями хромосом (например, синдром Дауна, синдром Эдвардса, синдром Патау) и крупными структурными перестройками, проявляющимися множественными пороками развития, задержкой психомоторного развития и интеллектуальными нарушениями.
• Репродуктивная медицина: У супружеских пар с бесплодием, привычным невынашиванием беременности или мертворождениями цитогенетические исследования позволяют выявить сбалансированные хромосомные перестройки (например, транслокации или инверсии) у одного из партнёров, которые могут приводить к формированию несбалансированных гамет и, как следствие, к репродуктивным неудачам.
• Пренатальная диагностика: Анализ хромосом у плода по образцам амниотической жидкости или ворсин хориона критически важен для выявления хромосомных аномалий до рождения, особенно при наличии факторов риска (возраст матери, аномальные результаты скрининга, наличие хромосомных перестроек у родителей). Это предоставляет родителям информацию для принятия информированных решений.
• Онкогематология и онкология: Многие онкологические заболевания, особенно лейкозы и лимфомы, характеризуются специфическими приобретёнными хромосомными перестройками (например, филадельфийская хромосома при хроническом миелолейкозе). Цитогенетический анализ позволяет не только диагностировать тип опухоли, но и определить прогноз заболевания, выбрать оптимальную тактику лечения и оценить эффективность терапии.
• Идентификация микроделеционных и микродупликационных синдромов: С развитием молекулярно-цитогенетических методов (FISH, aCGH) стало возможным диагностировать синдромы, вызванные потерей или дупликацией очень маленьких участков хромосом, которые не видны при стандартном кариотипировании. Примерами являются синдром Ди Джорджи, синдром Вильямса и другие.
• Генетическое консультирование: Результаты цитогенетических исследований являются краеугольным камнем для генетического консультирования, помогая семьям понять риски повторного возникновения генетических аномалий, планировать будущие беременности и принимать осознанные решения относительно здоровья.

Благодаря этим возможностям цитогенетические методы остаются незаменимым инструментом в арсенале генетиков и клиницистов, постоянно расширяя границы наших знаний о генетической основе здоровья и болезней.

Классическое кариотипирование: возможности и ограничения традиционного анализа хромосом

Классическое кариотипирование представляет собой фундаментальный цитогенетический метод, который позволяет исследовать полный хромосомный набор человека под микроскопом. Этот традиционный анализ направлен на выявление числовых и крупных структурных аномалий хромосом, которые являются причиной многих наследственных заболеваний, врожденных пороков развития и репродуктивных нарушений. Суть метода заключается в микроскопическом изучении метафазных хромосом, предварительно окрашенных специальными красителями для создания уникального рисунка полос, что обеспечивает идентификацию каждой хромосомы и обнаружение видимых перестроек.

Принципы и этапы проведения кариотипирования

Проведение классического кариотипирования является многоступенчатым процессом, требующим соблюдения строгих лабораторных протоколов. Для анализа используются клетки, способные к делению, чаще всего лимфоциты периферической крови, фибробласты кожи, клетки амниотической жидкости или ворсин хориона.

Основные этапы проведения кариотипирования включают:

• Получение образца: Забор биологического материала, содержащего живые клетки (кровь, амниотическая жидкость, биоптат).
• Культивирование клеток: Клетки инкубируют в питательной среде в течение 2-3 дней, стимулируя их деление. Это обеспечивает достаточное количество клеток для анализа.
• Остановка митоза: На определенном этапе к культуре добавляют колхицин или его аналоги, которые блокируют образование веретена деления. Это приводит к остановке клеток в метафазе — стадии, когда хромосомы максимально конденсированы и хорошо видны.
• Гипотонический шок и фиксация: Клетки обрабатывают гипотоническим раствором, чтобы вызвать их набухание и расхождение хромосом. Затем их фиксируют, что сохраняет структуру хромосом.
• Приготовление препаратов: Клеточную суспензию наносят на предметные стекла, где клетки разрушаются, а хромосомы равномерно распределяются.
• Дифференциальное окрашивание: Препараты окрашивают специальными красителями (наиболее часто используется G-окрашивание, или окрашивание по Гимзе), которые создают на хромосомах уникальный полосчатый рисунок. Этот рисунок специфичен для каждой пары хромосом и позволяет их идентифицировать.
• Микроскопический анализ и фотографирование: Специалист под микроскопом анализирует не менее 20-30 метафазных пластинок, оценивая число и структуру хромосом. Выбираются наиболее качественные метафазы, которые фотографируются.
• Составление кариограммы: С помощью компьютерных программ хромосомы вырезаются из фотографий, упорядочиваются по размеру и форме в соответствии с международной классификацией (Денверская классификация) и формируется кариограмма — систематизированное изображение всего хромосомного набора.
• Интерпретация результатов: Оценивается наличие числовых аномалий (например, дополнительные или отсутствующие хромосомы) и структурных перестроек (делеции, дупликации, транслокации, инверсии).

Возможности и диагностическая ценность традиционного кариотипирования

Классическое кариотипирование остается "золотым стандартом" для выявления широкого спектра хромосомных аномалий. Этот метод позволяет получить общую картину хромосомного набора и обнаружить как числовые, так и достаточно крупные структурные изменения.

С помощью традиционного анализа хромосом можно диагностировать следующие типы нарушений:

• Числовые аномалии хромосом (анеуплоидии):
  • Трисомии (наличие дополнительной хромосомы), например, синдром Дауна (трисомия 21), синдром Эдвардса (трисомия 18), синдром Патау (трисомия 13).
  • Моносомии (отсутствие одной хромосомы), например, синдром Шерешевского-Тернера (моносомия по X-хромосоме).
  • Полиплоидии (наличие кратного набора хромосом, например, триплоидия).
  • Аномалии половых хромосом, такие как синдром Клайнфельтера (XXY).
• Крупные структурные перестройки:
  • Сбалансированные и несбалансированные транслокации (обмен участками между негомологичными хромосомами).
  • Делеции (потеря участка хромосомы), если их размер превышает 5-10 миллионов пар оснований (Мб).
  • Дупликации (удвоение участка хромосомы) аналогичного размера.
  • Инверсии (поворот участка хромосомы на 180 градусов).
  • Кольцевые хромосомы, изохромосомы и дицентрические хромосомы.

Разрешающая способность классического кариотипирования обычно составляет около 5-10 Мб, что означает, что перестройки меньшего размера могут быть невидимы под микроскопом. Тем не менее, метод остается незаменимым для первичной диагностики при подозрении на крупномасштабные хромосомные аномалии.

Ограничения классического анализа хромосом

Несмотря на свои преимущества, классическое кариотипирование имеет ряд ограничений, которые могут влиять на его диагностическую эффективность в определенных клинических ситуациях. Понимание этих ограничений позволяет врачам выбирать наиболее подходящие методы исследования.

Основные ограничения традиционного кариотипирования включают:

• Низкая разрешающая способность: Метод не позволяет выявлять микроделеции и микродупликации (размером менее 5-10 Мб), которые являются причиной многих генетических синдромов (например, синдром Ди Джорджи, синдром Вильямса). Для их диагностики требуются молекулярно-цитогенетические методы.
• Невозможность обнаружения точковых мутаций: Изменения на уровне отдельных нуклеотидов или небольших участков генов полностью недоступны для кариотипирования.
• Ограниченная детекция мозаицизма: При низком уровне мозаицизма (наличии нескольких клеточных линий с разным набором хромосом) метод может не выявить аномальную линию, если она присутствует в менее чем 10-15% анализируемых клеток.
• Требование к делящимся клеткам: Для анализа необходимы живые, активно делящиеся клетки, что делает невозможным исследование на некоторых типах тканей или в случае гибели клеток.
• Времязатратность: Процесс культивирования клеток и подготовки препаратов занимает несколько дней, что может быть критично в условиях, требующих быстрой диагностики (например, в некоторых случаях пренатальной диагностики).
• Невозможность выявления сбалансированных перестроек без фенотипических проявлений: Некоторые сбалансированные перестройки (например, инверсии) могут быть невидимы, если они не изменяют полосчатый рисунок или не приводят к изменению длины хромосомы. При этом носители таких перестроек могут быть здоровы, но иметь репродуктивные проблемы.
• Субъективность интерпретации: Несмотря на стандартизацию, оценка полосчатого рисунка и выявление тонких перестроек могут требовать высокой квалификации и опыта специалиста.

Сравнение возможностей и ограничений кариотипирования

Для наглядности основные возможности и ограничения классического кариотипирования представлены в следующей таблице:

Таким образом, классическое кариотипирование, несмотря на свои ограничения, остается краеугольным камнем цитогенетической диагностики, предоставляя важную информацию о крупномасштабных изменениях в геноме человека. Однако для более детального исследования и выявления мелких хромосомных перестроек часто требуется применение более современных молекулярно-цитогенетических методов.

Метод FISH (флуоресцентная гибридизация in situ): прицельный поиск генетических изменений

Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) представляет собой молекулярно-цитогенетический подход, который позволяет визуализировать специфические участки хромосом или отдельные гены непосредственно в ядре клетки. В отличие от классического кариотипирования, этот метод обладает значительно более высоким разрешением и предназначен для прицельного выявления микроскопических хромосомных аномалий, таких как микроделеции, микродупликации, а также сложных перестроек, которые остаются невидимыми при стандартном анализе.

Принцип метода FISH: как флуоресцентные зонды находят генетические аномалии

Основной принцип метода FISH основан на способности коротких фрагментов ДНК (зондов), меченых флуоресцентными красителями, связываться (гибридизироваться) с комплементарными им участками ДНК на хромосомах пациента. Процесс гибридизации происходит "in situ", то есть непосредственно на препарате с исследуемыми клетками.

Последовательность шагов для обнаружения генетических изменений включает:

• Подготовка образца: Клетки пациента фиксируются на предметном стекле.
• Денатурация ДНК: Двойная спираль ДНК в клетках, а также ДНК в составе флуоресцентного зонда, разделяются на одиночные нити путем нагревания.
• Гибридизация: Флуоресцентно меченый зонд наносится на препарат. Благодаря комплементарности, зонд специфически связывается с целевым участком ДНК на хромосомах.
• Визуализация: После удаления несвязавшегося зонда препарат исследуется под флуоресцентным микроскопом. Участки хромосом, где произошла гибридизация, ярко светятся, указывая на наличие или отсутствие искомой генетической последовательности.

Яркие флуоресцентные сигналы позволяют специалисту точно определить локализацию целевого гена или участка хромосомы, выявить его отсутствие (делецию), удвоение (дупликацию) или необычное расположение (транслокацию).

Виды FISH-зондов и их применение

Для различных диагностических задач используются специфические типы FISH-зондов, каждый из которых обладает уникальными возможностями для поиска генетических изменений. Выбор зонда определяется клинической картиной и предполагаемой хромосомной аномалией.

Основные виды FISH-зондов и области их применения:

• Центромерные зонды (Centromere Enumeration Probes, CEP): Эти зонды связываются с высокоповторяющимися последовательностями ДНК в области центромер конкретных хромосом. Используются для быстрого выявления числовых аномалий (анеуплоидий), таких как трисомии (например, трисомия 21 при синдроме Дауна, трисомия 18, трисомия 13) и аномалии половых хромосом (например, синдром Шерешевского-Тернера, синдром Клайнфельтера).
• Локус-специфичные зонды (Locus Specific Identifier, LSI): Разработаны для гибридизации с конкретными, уникальными последовательностями ДНК, расположенными в определенных локусах (участках) хромосом. Эти зонды незаменимы для диагностики микроделеционных и микродупликационных синдромов, вызванных потерей или удвоением небольших сегментов хромосом, которые не видны при кариотипировании (например, синдром Ди Джорджи, синдром Вильямса). Также применяются для выявления специфических генных перестроек при онкологических заболеваниях.
• Теломерные зонды (Subtelomere Probes): Ориентированы на концевые участки хромосом (теломеры). Используются для обнаружения несбалансированных перестроек, затрагивающих теломерные регионы, которые часто ассоциированы с умственной отсталостью и множественными пороками развития, но могут быть пропущены стандартным кариотипированием.
• Зонды для раскрашивания всей хромосомы (Whole Chromosome Paint, WCP): Представляют собой смесь зондов, покрывающих всю длину одной конкретной хромосомы. Они используются для идентификации сложных хромосомных перестроек, таких как транслокации, в которых участвуют целые хромосомы или их крупные сегменты, особенно при выявлении криптических (скрытых) транслокаций.
• Зонды для анализа слияний (Fusion Probes): Предназначены для выявления специфических слияний генов, которые образуются в результате хромосомных транслокаций. Часто применяются в онкогематологии для диагностики и мониторинга лейкозов и лимфом (например, BCR-ABL слияние при хроническом миелолейкозе).

Этапы проведения FISH-анализа

Проведение FISH-анализа включает несколько ключевых этапов, обеспечивающих точное выявление генетических изменений:

1. Получение биологического образца: Для исследования подходят различные типы клеток, способных к делению, или интерфазные ядра. Чаще всего используются лимфоциты периферической крови, клетки амниотической жидкости, ворсин хориона, костного мозга, биоптаты опухолей.
2. Подготовка цитогенетических препаратов: Клетки из образца культивируются (если это необходимо для увеличения их количества), фиксируются и наносятся на предметное стекло. Затем проводится денатурация ДНК для разделения двойных спиралей на одиночные нити, что делает их доступными для связывания с зондами.
3. Гибридизация: На подготовленные препараты наносится специфический флуоресцентный зонд или их комбинация. Препарат инкубируется в течение нескольких часов при определенной температуре, что позволяет зондам связаться с комплементарными участками ДНК на хромосомах.
4. Отмывка: После гибридизации препараты тщательно отмываются для удаления несвязавшихся зондов и снижения неспецифического фона, что обеспечивает чистоту сигнала.
5. Микроскопический анализ: Препараты исследуются под специализированным флуоресцентным микроскопом, который позволяет увидеть флуоресцентные сигналы. Опытный специалист анализирует количество, размер и расположение этих сигналов в сотнях клеток, а также сопоставляет их с морфологией хромосом, если анализ проводится на метафазных хромосомах.
6. Интерпретация результатов: На основе анализа флуоресцентных сигналов формируется заключение о наличии или отсутствии искомой хромосомной аномалии.

Диагностические возможности и преимущества метода FISH

Метод флуоресцентной гибридизации in situ значительно расширяет возможности цитогенетической диагностики, предлагая высокую специфичность и чувствительность. Он позволяет решать задачи, недоступные классическому кариотипированию.

Основные диагностические возможности и преимущества FISH:

• Выявление микроделеционных и микродупликационных синдромов: Это одно из ключевых преимуществ FISH. Метод позволяет диагностировать генетические синдромы, вызванные потерей или удвоением небольших участков хромосом (например, размером от десятков тысяч до нескольких миллионов пар оснований), которые неразличимы при стандартном микроскопическом исследовании хромосом (например, синдром Ди Джорджи (22q11.2 микроделеция), синдром Вильямса (7q11.23 микроделеция)).
• Экспресс-диагностика анеуплоидий: В пренатальной диагностике FISH-анализ с использованием центромерных зондов может быть выполнен на интерфазных ядрах клеток амниотической жидкости или ворсин хориона, что позволяет получить результат о наличии частых хромосомных аномалий (трисомий 13, 18, 21 и анеуплоидий половых хромосом) в течение 24-48 часов, значительно быстрее, чем классическое кариотипирование.
• Идентификация скрытых (криптических) хромосомных перестроек: FISH способен выявлять транслокации или инверсии, которые не изменяют общий размер или полосчатый рисунок хромосом и поэтому не обнаруживаются при рутинном кариотипировании. Это особенно важно для диагностики репродуктивных проблем у носителей сбалансированных перестроек.
• Обнаружение специфических онкологических перестроек: Метод широко применяется в онкогематологии для выявления диагностически значимых транслокаций и генных слияний (например, t(9;22) — филадельфийская хромосома при хроническом миелолейкозе, t(15;17) при остром промиелоцитарном лейкозе). Это помогает в постановке точного диагноза, определении прогноза и выборе целевой терапии.
• Анализ интерфазных ядер: В отличие от кариотипирования, FISH не всегда требует метафазных хромосом и может быть выполнен на интерфазных ядрах (неделящихся клетках), что ускоряет процесс и позволяет исследовать образцы с низким митотическим индексом.
• Выявление мозаицизма: Флуоресцентная гибридизация in situ более чувствительна к обнаружению низкоуровневого мозаицизма (присутствие нескольких клеточных линий с разным набором хромосом), чем классическое кариотипирование.

Ограничения флуоресцентной гибридизации in situ

Несмотря на свои значительные преимущества, метод FISH имеет и ряд ограничений, которые необходимо учитывать при выборе диагностического подхода.

Основные ограничения метода FISH:

• Прицельный характер анализа: FISH является целевым методом. Он выявляет только те хромосомные аномалии, для которых был разработан и использован специфический флуоресцентный зонд. Если у пациента присутствует иная, непредполагаемая аномалия, для которой зонд не был применен, она останется невыявленной.
• Невозможность обнаружения точковых мутаций: Метод FISH работает на уровне хромосом и их крупных сегментов. Он не способен выявлять точковые мутации, инсерции или делеции отдельных нуклеотидов или очень маленьких фрагментов ДНК в пределах одного гена, которые являются причиной многих моногенных заболеваний.
• Требование предварительного знания: Для успешного проведения FISH-анализа часто необходимо иметь предварительное клиническое подозрение на конкретную хромосомную аномалию, чтобы правильно выбрать соответствующий зонд.
• Ограниченное разрешение для очень мелких изменений: Хотя разрешение FISH значительно выше, чем у кариотипирования, существуют субмикроскопические изменения генома, которые могут быть слишком малы для обнаружения этим методом и требуют более высокоразрешающих технологий, таких как сравнительная геномная гибридизация на микроматрицах (aCGH) или секвенирование нового поколения.
• Трудности в выявлении сбалансированных перестроек: FISH-метод не всегда позволяет обнаружить сбалансированные хромосомные перестройки (например, сбалансированные транслокации или инверсии), если зонд не охватывает точные точки разрыва или если не используется специальная панель зондов для анализа слияний. Это происходит потому, что при сбалансированной перестройке количество генетического материала не изменяется, а лишь происходит его перераспределение.

Сравнение FISH с классическим кариотипированием

Для понимания места метода FISH в арсенале цитогенетических исследований полезно сравнить его с классическим кариотипированием, которое было описано ранее.

Таким образом, метод флуоресцентной гибридизации in situ является мощным и высокоточным инструментом для целенаправленного выявления генетических изменений на хромосомном уровне, дополняя и расширяя возможности классического кариотипирования в диагностике сложных наследственных и приобретенных заболеваний.

Сравнительная геномная гибридизация (CGH и aCGH): высокоточное сканирование всего генома

Сравнительная геномная гибридизация (CGH) и ее современная высокопроизводительная модификация — сравнительная геномная гибридизация на микроматрицах (array CGH, aCGH) — представляют собой молекулярно-цитогенетические методы, предназначенные для выявления несбалансированных изменений в количестве генетического материала по всему геному. Эти технологии позволяют обнаружить дополнительные (дупликации) или отсутствующие (делеции) участки хромосом, которые могут быть причиной многих генетических заболеваний, синдромов развития и онкологических состояний. В отличие от классического кариотипирования и метода FISH, сравнительная геномная гибридизация не требует предварительного подозрения на конкретную хромосомную аномалию и сканирует весь геном с значительно более высоким разрешением.

Принцип метода CGH: анализ ДНК всего генома

Классический метод сравнительной геномной гибридизации (CGH) основан на сравнении количества ДНК пациента с количеством ДНК здорового контрольного образца. Этот процесс позволяет выявить несбалансированные изменения в хромосомном наборе, которые приводят к изменению дозы генов.

Основные этапы проведения CGH включают:

• Выделение ДНК: Отдельно выделяется ДНК из клеток пациента (тестируемая ДНК) и ДНК из клеток здорового человека (референсная ДНК).
• Мечение флуоресцентными красителями: Тестируемая ДНК метится одним флуоресцентным красителем (например, красным), а референсная ДНК — другим (например, зеленым).
• Совместная гибридизация: Обе меченые ДНК смешиваются в равных пропорциях и наносятся на препарат с метафазными хромосомами здорового человека. Меченые фрагменты ДНК гибридизируются (связываются) с комплементарными им участками на этих хромосомах.
• Анализ изображений: Препарат исследуется под флуоресцентным микроскопом, подключенным к компьютерной системе. Анализируется соотношение интенсивностей красного и зеленого флуоресцентных сигналов вдоль каждой хромосомы.

При нормальном количестве генетического материала в исследуемом участке соотношение сигналов красного и зеленого красителей будет примерно равно единице. Если у пациента присутствует делеция (потеря участка) на определенной хромосоме, то в этом месте будет преобладать зеленый сигнал (от референсной ДНК), а если дупликация (удвоение участка), то преобладает красный сигнал (от ДНК пациента). Таким образом, метод позволяет обнаружить участки хромосом с измененным числом копий.

Сравнительная геномная гибридизация на микроматрицах (array CGH, aCGH): новая эра геномной диагностики

Сравнительная геномная гибридизация на микроматрицах (aCGH), или хромосомный микроматричный анализ (ХМА), является усовершенствованной версией классического CGH и представляет собой одну из наиболее мощных технологий для полногеномного скрининга несбалансированных хромосомных аномалий. Ключевое отличие заключается в том, что гибридизация происходит не на метафазных хромосомах, а на специализированной микроматрице (чипе), содержащей тысячи или миллионы фиксированных фрагментов ДНК (зондов).

Процесс aCGH включает:

1. Подготовка образцов ДНК: Выделение ДНК пациента и контрольной ДНК, их фрагментация и мечение разными флуоресцентными красителями, как и в классическом CGH.
2. Гибридизация на микроматрице: Смесь меченых ДНК наносится на микроматрицу, где происходит гибридизация с тысячами или миллионами зондов, расположенных в различных участках генома. Каждый зонд представляет собой известный фрагмент ДНК с определенной хромосомной локализацией.
3. Сканирование и анализ данных: После гибридизации и отмывки микроматрица сканируется лазерным сканером, который измеряет интенсивность флуоресценции каждого красителя для каждого зонда. Полученные данные обрабатываются сложными биоинформатическими программами, которые строят график соотношения сигналов по всему геному.

Любое отклонение от нормального соотношения (например, увеличение красного сигнала над зеленым или наоборот) указывает на наличие дупликации или делеции в соответствующем участке генома пациента. Высокая плотность зондов на микроматрице обеспечивает беспрецедентно высокое разрешение, позволяя обнаруживать даже очень мелкие изменения, которые не видны при других методах.

Виды aCGH микроматриц и их разрешающая способность

Эффективность и диагностические возможности сравнительной геномной гибридизации на микроматрицах во многом зависят от типа используемой микроматрицы, а именно от плотности и типа зондов. Существуют различные виды микроматриц, разработанные для специфических клинических задач, и их разрешающая способность может значительно варьироваться.

Основные виды микроматриц и их характеристики:

• Олигонуклеотидные микроматрицы: Наиболее распространенный тип, использующий короткие синтетические фрагменты ДНК (олигонуклеотиды) в качестве зондов. Они могут быть разработаны с очень высокой плотностью, позволяя покрывать весь геном с равномерным распределением или фокусироваться на клинически значимых регионах. Разрешающая способность таких матриц обычно составляет от нескольких сотен килобаз (кб) до десятков кб, а в некоторых случаях может достигать и единиц кб.
• SNP-микроматрицы (микроматрицы однонуклеотидного полиморфизма): Эти микроматрицы содержат зонды, специфичные для однонуклеотидных полиморфизмов (SNP). Помимо обнаружения изменений числа копий ДНК, они также способны выявлять потерю гетерозиготности (LOH) и однородительскую дисомию (UPD), которые не могут быть обнаружены стандартными олигонуклеотидными aCGH. Их разрешение также очень высокое.

Разрешающая способность aCGH определяет минимальный размер делеции или дупликации, которую метод способен обнаружить. Чем выше плотность зондов на микроматрице (то есть чем меньше расстояние между соседними зондами), тем выше разрешение метода. Например, микроматрицы с разрешением 100 кб способны обнаружить изменения размером 100 000 пар оснований, тогда как микроматрицы с разрешением 10 кб могут выявить изменения в 10 раз меньше. Это значительно превосходит разрешающую способность классического кариотипирования (5-10 Мб) и FISH (десятки-сотни кб для целевых зондов).

Диагностические возможности и преимущества CGH/aCGH

Сравнительная геномная гибридизация, особенно ее микроматричная версия, обладает широким спектром диагностических возможностей и значительными преимуществами перед другими цитогенетическими методами, что делает ее незаменимым инструментом в современной генетической диагностике.

Основные диагностические возможности и преимущества:

• Высочайшая разрешающая способность: aCGH позволяет выявлять микроделеции и микродупликации размером от десятков до нескольких сотен килобаз, которые являются причиной многих наследственных синдромов и невидимы при стандартном кариотипировании.
• Полногеномный скрининг: Метод сканирует весь геном на предмет несбалансированных изменений числа копий ДНК без необходимости предварительного знания о локализации аномалии. Это позволяет обнаружить непредполагаемые хромосомные перестройки.
• Диагностика необъяснимых задержек развития: Является методом выбора первой линии для пациентов с необъяснимой умственной отсталостью, задержкой психомоторного развития, аутистическим спектром, множественными врожденными пороками развития, когда кариотип нормален.
• Пренатальная диагностика: Применяется для анализа хромосомных аномалий у плода при наличии ультразвуковых маркеров или аномальных результатов биохимического скрининга, особенно когда стандартный кариотип нормален, но клинические подозрения сохраняются.
• Онкологическая диагностика: Широко используется для выявления приобретенных соматических изменений числа копий ДНК в опухолевых клетках, что важно для диагностики, прогноза и выбора таргетной терапии при различных видах рака.
• Независимость от делящихся клеток: В отличие от классического кариотипирования, для aCGH не требуются живые, делящиеся клетки, что позволяет исследовать ДНК из различных биологических материалов (например, замороженных тканей, парафиновых блоков, образцов после гибели плода).
• Выявление несбалансированных транслокаций: Эффективно обнаруживает все типы несбалансированных транслокаций, приводящих к потере или приобретению генетического материала.
• Обнаружение участков гомозиготности: SNP-микроматрицы могут выявлять протяженные участки гомозиготности (LOH), что может указывать на однородительскую дисомию или родственные браки.

Ограничения сравнительной геномной гибридизации

Несмотря на высокую разрешающую способность и широкий спектр применения, сравнительная геномная гибридизация имеет определенные ограничения, которые необходимо учитывать при выборе метода диагностики.

Основные ограничения метода CGH и aCGH:

• Невозможность выявления сбалансированных хромосомных перестроек: Метод не обнаруживает сбалансированные транслокации или инверсии, поскольку они не приводят к изменению общего количества генетического материала (то есть, нет ни потери, ни приобретения ДНК). Носители таких перестроек могут быть фенотипически здоровы, но имеют высокий риск рождения детей с несбалансированными аномалиями.
• Неспособность обнаружения точковых мутаций: Сравнительная геномная гибридизация анализирует изменения числа копий участков хромосом, но не выявляет изменения на уровне отдельных нуклеотидов (точковые мутации) или очень маленьких инсерций/делеций в пределах одного гена. Для этого требуются методы секвенирования ДНК.
• Ограниченная детекция низкоуровневого мозаицизма: Хотя aCGH более чувствительна к мозаицизму, чем кариотипирование, ее способность обнаружить аномальную клеточную линию снижается, если доля аномальных клеток составляет менее 10-20% от общего числа.
• Невозможность обнаружения полиплоидии: Метод не может выявить полиплоидию (например, триплоидию), так как при этом нарушении происходит пропорциональное увеличение всего генома, и соотношение ДНК пациента и референсной ДНК остается неизменным.
• Выявление вариантов с неопределенным клиническим значением (VOUS): Высокое разрешение метода может приводить к обнаружению многочисленных вариантов числа копий (CNV), клиническое значение которых на данный момент неизвестно. Это может затруднять интерпретацию результатов и требовать дополнительных исследований или семейного анализа.
• Высокая стоимость: aCGH является более дорогостоящим методом по сравнению с классическим кариотипированием и FISH, что может ограничивать его доступность.
• Требования к биоинформатической интерпретации: Анализ большого объема данных, полученных с микроматриц, требует специализированных биоинформатических инструментов и высококвалифицированных специалистов для правильной интерпретации результатов.

Сравнение CGH/aCGH с другими цитогенетическими методами

Для более полного понимания места сравнительной геномной гибридизации в спектре цитогенетических исследований, целесообразно рассмотреть ее ключевые отличия от классического кариотипирования и метода FISH.

Таким образом, сравнительная геномная гибридизация на микроматрицах представляет собой высокоэффективный метод для всестороннего анализа генома на предмет несбалансированных хромосомных аномалий, особенно ценный в случаях, когда классические методы оказываются недостаточно информативными.

Современные молекулярно-цитогенетические методы: QF-PCR, MLPA и их применение в диагностике

Помимо таких фундаментальных подходов, как классическое кариотипирование, флуоресцентная гибридизация на месте (FISH) и сравнительная геномная гибридизация на микроматрицах (aCGH), в арсенале генетической диагностики присутствуют и другие современные молекулярно-цитогенетические методы. Они предлагают уникальные возможности для быстрого и точного выявления специфических хромосомных аномалий, особенно актуальных в пренатальной диагностике и при поиске причин наследственных заболеваний. Среди них выделяются количественная флуоресцентная полимеразная цепная реакция (QF-PCR) и мультиплексная лигазная проба на месте (MLPA).

Количественная флуоресцентная полимеразная цепная реакция (QF-PCR): экспресс-диагностика анеуплоидий

Метод QF-PCR (Количественная флуоресцентная полимеразная цепная реакция) представляет собой быстрый и высокочувствительный молекулярно-цитогенетический тест, разработанный для выявления числовых аномалий хромосом, или анеуплоидий. Он основан на полимеразной цепной реакции с использованием флуоресцентно меченых праймеров, что позволяет количественно оценить число копий определенных хромосом в образце ДНК.

Принцип работы и аналитические возможности QF-PCR

Принцип количественной флуоресцентной полимеразной цепной реакции заключается в амплификации (многократном копировании) коротких тандемных повторов (STR-маркеров), которые располагаются на исследуемых хромосомах. Эти маркеры являются высокополиморфными, то есть их длина варьируется у разных людей, что позволяет отличать хромосомы, унаследованные от разных родителей.

Этапы проведения QF-PCR:

1. Выделение ДНК: Из образца пациента (например, амниотической жидкости, ворсин хориона или периферической крови) выделяется общая ДНК.
2. Амплификация с флуоресцентными праймерами: С помощью специфических праймеров, меченых флуоресцентными красителями, проводится ПЦР для амплификации выбранных STR-маркеров на интересующих хромосомах (например, хромосомах 13, 18, 21, X и Y).
3. Электрофоретический анализ: Амплифицированные фрагменты ДНК разделяются по длине с помощью капиллярного электрофореза. Флуоресцентные сигналы обнаруживаются, и программное обеспечение строит профиль пиков, отражающих количество и размер каждого маркера.
4. Количественная оценка: При нормальном диплоидном наборе хромосом (две гомологичные хромосомы) наблюдается два пика равной интенсивности (гетерозиготный вариант) или один пик удвоенной интенсивности (гомозиготный вариант). При наличии трисомии (три копии хромосомы) обнаруживается либо три пика (различные аллели), либо два пика с соотношением интенсивностей 2:1 (один аллель в двух копиях, другой — в одной), либо один пик утроенной интенсивности. Моносомия (одна копия) будет проявляться одним пиком в случае гетерозиготности.

Метод QF-PCR позволяет с высокой точностью и скоростью диагностировать наиболее частые анеуплоидии: трисомии 13 (синдром Патау), 18 (синдром Эдвардса) и 21 (синдром Дауна), а также числовые аномалии половых хромосом (синдром Шерешевского-Тернера, синдром Клайнфельтера).

Преимущества и ограничения QF-PCR

Количественная флуоресцентная полимеразная цепная реакция имеет ряд существенных преимуществ, особенно в условиях, требующих оперативной диагностики:

• Высокая скорость: Результаты могут быть получены в течение 24-48 часов, что критически важно для пренатальной диагностики, когда необходимо быстро принять решение.
• Высокая чувствительность: Метод позволяет анализировать небольшие количества ДНК, что делает его пригодным для исследования различных биологических материалов.
• Точность: QF-PCR демонстрирует высокую точность в определении числа копий целевых хромосом.
• Независимость от делящихся клеток: В отличие от классического кариотипирования, QF-PCR анализирует ДНК из любых клеток, независимо от их способности к делению, что расширяет спектр исследуемых образцов.

Несмотря на свои достоинства, QF-PCR обладает и ограничениями:

• Целенаправленный характер: Метод ориентирован только на выявление заранее определенных анеуплоидий (чаще всего 13, 18, 21, X, Y хромосом) и не способен обнаружить другие числовые или структурные аномалии, не входящие в панель исследуемых маркеров.
• Невозможность обнаружения сбалансированных перестроек: QF-PCR не выявляет сбалансированные транслокации или инверсии, так как они не приводят к изменению общего числа копий ДНК.
• Ограниченное обнаружение мозаицизма: При низком уровне мозаицизма (менее 10-15% аномальных клеток) метод может быть неэффективным.
• Не обнаруживает полиплоидии: Подобно aCGH, QF-PCR не может диагностировать полиплоидии, поскольку количество копий всех хромосом увеличивается пропорционально.

Мультиплексная лигазная проба на месте (MLPA): детальный анализ числа копий генов

MLPA (Мультиплексная лигазозависимая амплификация зондов), или мультиплексная лигазная проба на месте, — это молекулярно-генетический метод, который позволяет одновременно исследовать число копий до 50-60 различных последовательностей ДНК в одном образце. Этот метод особенно ценен для обнаружения мелких делеций и дупликаций (изменений числа копий), которые могут затрагивать один или несколько генов и являются причиной многих микроделеционных/микродупликационных синдромов, а также наследственных заболеваний, связанных с изменением дозы генов.

Принцип работы и аналитические возможности MLPA

Принцип мультиплексной лигазной пробы на месте основан на избирательном связывании специфических зондов с целевыми последовательностями ДНК, их последующем лигировании (соединении) и амплификации. Каждый набор MLPA-зондов разработан для конкретной диагностической задачи, например, для выявления синдрома Ди Джорджи, синдрома Вильямса или других.

Основные этапы проведения MLPA:

1. Денатурация ДНК: ДНК пациента денатурируется (разделяется на две нити), чтобы сделать ее доступной для гибридизации с зондами.
2. Гибридизация с зондами: Смесь MLPA-зондов инкубируется с ДНК пациента. Каждый MLPA-зонд состоит из двух полузондов, которые гибридизируются с двумя соседними участками целевой последовательности ДНК.
3. Лигирование: Если оба полузонда успешно гибридизовались с ДНК, фермент лигаза соединяет их, образуя цельный зонд.
4. Амплификация ПЦР: Все лигированные зонды имеют одинаковые универсальные последовательности на концах, что позволяет амплифицировать их в ходе ПЦР с использованием одной пары праймеров, один из которых флуоресцентно мечен. Важно, что каждый лигированный зонд имеет уникальную, заранее определенную длину.
5. Электрофоретический анализ: Амплифицированные фрагменты разделяются по длине с помощью капиллярного электрофореза, и флуоресцентные сигналы обнаруживаются.
6. Количественный анализ: Интенсивность флуоресцентного сигнала каждого зонда пропорциональна числу копий соответствующей целевой последовательности ДНК в образце. Сравнение интенсивности сигналов пациента с контрольным образцом позволяет выявить делеции (уменьшение сигнала) или дупликации (увеличение сигнала).

MLPA используется для диагностики широкого спектра состояний, включая микроделеционные и микродупликационные синдромы (например, синдром Ди Джорджи, синдром Вильямса, синдром Прадера-Вилли), а также для выявления изменений числа копий отдельных генов, связанных с наследственными заболеваниями (например, муковисцидоз, спинальная мышечная атрофия) или предрасположенностью к раку (например, гены BRCA1/2).

Преимущества и ограничения MLPA

Метод MLPA занимает важное место в генетической диагностике благодаря своим уникальным возможностям:

• Высокое разрешение: MLPA позволяет выявлять делеции и дупликации размером до нескольких тысяч пар оснований, что значительно выше разрешающей способности классического кариотипирования и даже некоторых FISH-зондов.
• Одновременный анализ многих регионов: Метод позволяет исследовать множество (до 50-60) различных локусов в одном тесте, делая его экономически эффективным для скрининга специфических генных панелей.
• Работа с различными образцами: MLPA может быть успешно выполнена на ДНК, выделенной из различных биологических материалов, включая ДНК низкого качества или частично деградированную (например, из фиксированных парафиновых блоков, что важно для онкологии).
• Обнаружение изменений числа копий генов: Это основной метод для точного определения количества копий специфических генов, что критично для диагностики некоторых наследственных заболеваний.

К ограничениям мультиплексной лигазной пробы на месте относятся:

• Целенаправленный подход: MLPA, как и QF-PCR, является целевым методом. Она выявляет только те изменения, для которых были разработаны специфические зонды. Непредполагаемые аномалии вне зондов останутся невыявленными.
• Не обнаруживает сбалансированные перестройки: Метод не чувствителен к сбалансированным транслокациям или инверсиям, так как они не меняют общего числа копий ДНК.
• Не выявляет точковые мутации: MLPA не предназначена для поиска точковых мутаций или очень мелких изменений последовательности ДНК внутри гена.
• Чувствительность к полиморфизмам: Наличие полиморфизмов в участках гибридизации зондов может привести к ложноположительным или ложноотрицательным результатам.
• Ограниченное обнаружение мозаицизма: При низком уровне мозаицизма (менее 10-20% аномальных клеток) обнаружение изменений может быть затруднено.

Сравнение QF-PCR и MLPA: выбор метода для конкретной задачи

Выбор между QF-PCR и MLPA зависит от конкретной диагностической задачи. Каждый из этих современных молекулярно-цитогенетических методов имеет свои оптимальные области применения, определяемые их разрешающей способностью, скоростью выполнения и спектром обнаруживаемых аномалий.

Для лучшего понимания их различий и областей применения, приведем сравнительную таблицу:

Таким образом, QF-PCR является оптимальным выбором, когда требуется максимально быстрая и надежная диагностика наиболее распространенных хромосомных анеуплоидий, особенно в экстренных ситуациях пренатального периода. MLPA, в свою очередь, незаменима для детального анализа числа копий ДНК в конкретных, клинически значимых регионах генома, позволяя выявлять мелкие генные и хромосомные перестройки, которые не видны при стандартном кариотипировании и требуют высокой специфичности.

Показания к цитогенетическому исследованию: в каких случаях назначают анализ хромосом

Цитогенетический анализ является ключевым диагностическим инструментом, позволяющим выявлять широкий спектр хромосомных аномалий, которые лежат в основе многих наследственных заболеваний, нарушений развития и репродуктивных проблем. Назначение цитогенетического исследования показано в различных клинических ситуациях, когда существует подозрение на изменение числа или структуры хромосом. Выбор конкретного цитогенетического метода (классическое кариотипирование, FISH, aCGH, QF-PCR, MLPA) зависит от характера предполагаемой патологии, возраста пациента и типа исследуемого образца.

Подозрение на хромосомные синдромы и нарушения развития у детей

Одним из наиболее частых показаний к проведению цитогенетического исследования является наличие у ребенка признаков, указывающих на возможный хромосомный синдром. Своевременный и точный анализ хромосом позволяет подтвердить диагноз, определить прогноз и разработать адекватный план ведения пациента.

• Задержка психомоторного и интеллектуального развития: Если ребенок значительно отстает от сверстников в развитии речи, двигательных навыков, социальных взаимодействиях или имеет умственную отсталость без явной причины, цитогенетическое исследование может выявить скрытые хромосомные перестройки, включая микроделеционные и микродупликационные синдромы, которые часто являются причиной таких нарушений.
• Множественные врожденные пороки развития: При рождении ребенка с несколькими несвязанными пороками развития, затрагивающими различные органы и системы (например, пороки сердца, почек, конечностей), анализ хромосом является обязательным для исключения или подтверждения хромосомной патологии.
• Дисморфические черты лица и тела: Наличие специфических внешних особенностей (особая форма глаз, ушей, носа, аномалии конечностей и т.д.), которые могут быть частью известных генетических синдромов (например, синдром Дауна, синдром Эдвардса, синдром Патау).
• Нарушения роста: Значительное отставание в росте (низкорослость) или, реже, чрезмерный рост, не связанные с эндокринными или алиментарными причинами, могут быть следствием хромосомных аномалий.
• Неопределенные половые признаки (интерсекс-состояния): У новорожденных с неоднозначным строением наружных половых органов цитогенетический анализ необходим для определения генетического пола и выявления возможных аномалий половых хромосом (например, синдром Шерешевского-Тернера, синдром Клайнфельтера) или других хромосомных перестроек, приводящих к нарушениям полового развития.

Репродуктивные проблемы и семейный анамнез

Цитогенетические исследования играют важнейшую роль в диагностике причин бесплодия, привычного невынашивания беременности и планировании семьи, особенно при наличии отягощенного наследственного анамнеза.

• Бесплодие: У супружеских пар, неспособных зачать ребенка в течение года регулярной незащищенной половой жизни, цитогенетический анализ (кариотипирование) назначается обоим партнерам. Это позволяет выявить сбалансированные хромосомные перестройки (например, транслокации или инверсии), которые не проявляются у носителя, но могут приводить к формированию несбалансированных гамет (сперматозоидов или яйцеклеток) и, как следствие, к бесплодию или рождению детей с тяжелыми патологиями.
• Привычное невынашивание беременности: При двух и более самопроизвольных прерываниях беременности (выкидышах) в первом или втором триместре исследование хромосом у обоих партнеров часто выявляет сбалансированные перестройки, которые являются причиной потери беременностей.
• Мертворождение или рождение ребенка с множественными пороками развития: В этих случаях показан цитогенетический анализ не только родителей, но и тканей плода (если это возможно) для установления причины и оценки рисков для будущих беременностей.
• Наличие в семье ребенка с подтвержденной хромосомной аномалией: Если у одного из детей диагностирована хромосомная патология, родителям необходимо пройти цитогенетическое исследование, чтобы исключить носительство сбалансированной перестройки, которая могла привести к рождению больного ребенка.

Пренатальная диагностика: анализ хромосом плода

Пренатальная цитогенетическая диагностика направлена на выявление хромосомных аномалий у плода еще до рождения. Она проводится инвазивными методами (амниоцентез, биопсия ворсин хориона) или неинвазивно (неинвазивный пренатальный тест, НИПТ), когда есть повышенный риск хромосомной патологии.

• Повышенный возраст матери (старше 35 лет): С возрастом женщины значительно увеличивается риск рождения ребенка с числовыми хромосомными аномалиями, такими как синдром Дауна (трисомия 21), синдром Эдвардса (трисомия 18) и синдром Патау (трисомия 13).
• Аномальные результаты скрининга беременных: Отклонения от нормы в биохимических маркерах первого или второго триместра беременности (например, изменения уровня ХГЧ, РАРР-А, альфа-фетопротеина) указывают на повышенный риск хромосомной патологии у плода.
• Обнаружение пороков развития или маркеров хромосомных аномалий при ультразвуковом исследовании (УЗИ): Выявление структурных аномалий плода (например, пороки сердца, аномалии почек, гидроцефалия) или мягких маркеров хромосомных аномалий (например, утолщение воротникового пространства, гипоплазия носовой кости) является прямым показанием к инвазивной пренатальной диагностике.
• Родители — носители сбалансированных хромосомных перестроек: Если один из родителей является носителем сбалансированной транслокации или инверсии, существует высокий риск передачи плоду несбалансированной формы, что требует обязательного цитогенетического анализа плода.
• Наличие в анамнезе ребенка с хромосомной патологией: Если в предыдущих беременностях был ребенок с хромосомной аномалией, риск повторения значительно возрастает.

Онкогематологические и онкологические заболевания

В онкологии и онкогематологии цитогенетический анализ используется не только для диагностики, но и для определения прогноза заболевания и выбора тактики лечения. Приобретенные хромосомные перестройки характерны для многих видов рака.

• Диагностика и классификация лейкозов и лимфом: Многие гематологические злокачественные новообразования характеризуются специфическими хромосомными транслокациями (например, филадельфийская хромосома t(9;22) при хроническом миелолейкозе, t(15;17) при остром промиелоцитарном лейкозе) или анеуплоидиями. Их выявление позволяет точно диагностировать тип опухоли.
• Прогнозирование течения заболевания: Некоторые хромосомные аномалии ассоциированы с более агрессивным течением или, наоборот, с лучшим ответом на терапию. Цитогенетический анализ помогает определить группу риска и индивидуализировать лечение.
• Мониторинг эффективности терапии: Отслеживание исчезновения или уменьшения количества клеток с патологическими хромосомными перестройками позволяет оценить эффективность лечения и выявить минимальную остаточную болезнь.
• Выявление соматических изменений при солидных опухолях: Сравнительная геномная гибридизация на микроматрицах (aCGH) может использоваться для обнаружения приобретенных делеций и дупликаций в ДНК солидных опухолей, что важно для понимания механизмов канцерогенеза и потенциального выбора таргетной терапии.

Общие показания к цитогенетическим исследованиям

Ниже представлена обобщенная таблица основных показаний для назначения цитогенетического исследования, а также ключевых задач, которые решаются с его помощью.

Выбор оптимального метода цитогенетического исследования всегда осуществляется врачом-генетиком или профильным специалистом с учетом полной клинической картины, анамнеза пациента и доступных диагностических возможностей. Это позволяет получить наиболее точную и полную информацию о состоянии хромосомного набора и принять информированные клинические решения.

Этапы проведения цитогенетического анализа: от образца до лабораторного заключения

Проведение цитогенетического анализа — это сложный многоступенчатый процесс, который начинается задолго до получения самого лабораторного заключения. Каждый этап от правильного забора биологического материала до финальной интерпретации данных имеет решающее значение для получения точного и достоверного результата. Понимание этих этапов поможет пациентам и их близким лучше ориентироваться в процессе диагностики и осознавать важность каждого шага.

Получение и первичная обработка биологического образца

Начальный и один из наиболее важных этапов цитогенетического исследования — это забор биологического материала, который содержит клетки или ДНК пациента. От качества и типа образца напрямую зависит возможность проведения анализа и его достоверность. Выбор материала определяется клинической ситуацией и конкретным цитогенетическим методом, который будет применяться.

• Кровь: Наиболее распространенный и доступный материал. Используется периферическая венозная кровь, из которой выделяют лимфоциты, способные к делению. Кровь применяется для классического кариотипирования, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), сравнительной геномной гибридизации на микроматрицах (aCGH), количественной флуоресцентной полимеразной цепной реакции (QF-PCR) и мультиплексной лигазной пробы на месте (MLPA) у детей и взрослых.
• Клетки амниотической жидкости: Получают методом амниоцентеза (прокол околоплодного пузыря) обычно на 16-20 неделях беременности. Эти клетки являются источником для пренатального кариотипирования, FISH, aCGH, QF-PCR.
• Ворсины хориона: Получают методом биопсии ворсин хориона на 10-14 неделях беременности. Клетки хориона также используются для пренатальной диагностики анеуплоидий, микроделеций и других хромосомных аномалий с помощью кариотипирования, FISH, aCGH, QF-PCR.
• Клетки костного мозга: Основной материал для диагностики онкогематологических заболеваний (лейкозов, лимфом) с помощью кариотипирования и FISH, так как позволяет выявить приобретенные хромосомные перестройки в кроветворных клетках.
• Биоптаты тканей (в том числе опухолевые): Используются для анализа соматических хромосомных аномалий в солидных опухолях или для мозаицизма, когда поражены только определенные ткани. Могут быть исследованы методами FISH, aCGH, MLPA.
• Слюна, буккальный эпителий (клетки внутренней поверхности щеки): Менее инвазивные методы, чаще используются для выделения ДНК для aCGH, QF-PCR, MLPA, но не подходят для классического кариотипирования из-за низкой митотической активности.

Первичная обработка включает быструю и бережную транспортировку образца в лабораторию в стерильных условиях, часто с соблюдением температурного режима, чтобы сохранить жизнеспособность клеток для дальнейшего культивирования, если это необходимо.

Культивирование клеток и остановка митоза

Некоторые цитогенетические методы, в частности классическое кариотипирование и часть FISH-анализов, требуют наличия активно делящихся клеток. Для этого проводится культивирование клеток из полученного биологического образца в специальных питательных средах.

• Культивирование клеток: Клетки инкубируют в течение 2-3 дней в условиях, имитирующих условия организма (оптимальная температура, влажность, CO2), добавляя митогены (например, фитогемагглютинин для лимфоцитов), которые стимулируют их к делению. Это позволяет получить достаточное количество клеток на разных стадиях митоза.
• Остановка митоза в метафазе: После достаточного роста культуры клеток на определенном этапе добавляется колхицин или его аналоги. Это вещество разрушает микротрубочки, которые формируют веретено деления, останавливая клетки в метафазе — стадии, когда хромосомы максимально конденсированы, хорошо различимы и имеют характерную X-образную форму. Эта стадия оптимальна для визуализации и анализа хромосом под микроскопом.

Для методов, основанных на анализе ДНК (aCGH, QF-PCR, MLPA), а также для некоторых FISH-анализов на интерфазных ядрах, этап культивирования и остановки митоза не является обязательным, что значительно ускоряет процесс получения результата.

Подготовка препаратов и обработка ДНК

После культивирования (если оно необходимо) или непосредственного выделения ДНК следуют этапы подготовки, специфичные для каждого метода, направленные на обеспечение оптимальной визуализации хромосом или доступности ДНК для гибридизации и амплификации.

Подготовка препаратов для кариотипирования и FISH:

Этот процесс направлен на получение равномерно распределенных и хорошо видимых метафазных хромосом.

• Гипотонический шок: Клетки обрабатывают гипотоническим раствором (с низкой концентрацией солей), что вызывает их набухание и расхождение хромосом внутри ядра, предотвращая их слипание.
• Фиксация: Затем клетки фиксируют смесью метанола и уксусной кислоты. Фиксатор убивает клетки, но сохраняет их структуру и морфологию хромосом, делая их пригодными для окрашивания.
• Приготовление препаратов на предметных стеклах: Фиксированную клеточную суспензию наносят на чистые предметные стекла. За счет поверхностного натяжения и высыхания капли клетки разрушаются, ядра лопаются, и хромосомы равномерно распределяются на стекле в виде метафазных пластинок.

Обработка ДНК для aCGH, QF-PCR, MLPA:

Для этих методов необходима высококачественная ДНК, выделенная из образца.

• Выделение ДНК: Из биологического образца выделяется общая геномная ДНК, очищается от белков и других клеточных компонентов.
• Фрагментация ДНК (для aCGH): Выделенная ДНК пациента и контрольная ДНК фрагментируются (разрезаются) на более мелкие, управляемые участки. Это необходимо для эффективной гибридизации на микроматрице.
• Мечение ДНК (для aCGH): Фрагментированная ДНК пациента и контрольная ДНК метятся разными флуоресцентными красителями, чтобы их можно было различить при последующем анализе.

Методы визуализации и гибридизации

После подготовки образцов применяются специфические техники для визуализации хромосом или детекции изменений в ДНК.

• Дифференциальное окрашивание (для классического кариотипирования): Препараты на стеклах окрашивают специальными красителями, чаще всего по Гимзе (G-окрашивание). Это создает уникальный полосчатый рисунок на каждой хромосоме, позволяя идентифицировать каждую пару хромосом и выявлять крупные структурные перестройки по изменению этого рисунка.
• Флуоресцентная гибридизация (для FISH): Подготовленные препараты подвергают денатурации, чтобы разделить двойные спирали ДНК на одиночные нити. Затем наносят флуоресцентно меченые ДНК-зонды, которые комплементарно связываются с искомыми участками хромосом. После инкубации и отмывки несвязавшихся зондов препарат готов к микроскопическому анализу.
• Геномная гибридизация на микроматрицах (для aCGH): Меченые ДНК пациента и контрольного образца смешиваются и наносятся на микроматрицу — чип, содержащий тысячи или миллионы фиксированных ДНК-зондов с известными геномными локализациями. Происходит конкурентная гибридизация, где фрагменты ДНК из образцов связываются с комплементарными зондами на чипе.
• Амплификация и лигирование (для QF-PCR и MLPA):
  • QF-PCR: Выделенную ДНК используют в полимеразной цепной реакции с флуоресцентно мечеными праймерами, специфичными для коротких тандемных повторов (STR-маркеров) на выбранных хромосомах. Это приводит к амплификации фрагментов ДНК, которые затем анализируются по длине и интенсивности флуоресценции.
  • MLPA: После денатурации ДНК пациента специальные зонды, состоящие из двух полузондов, гибридизируются с целевыми участками ДНК. Затем фермент лигаза соединяет эти полузонды. Все лигированные зонды содержат одинаковые универсальные праймерные последовательности, что позволяет амплифицировать их в одной ПЦР с флуоресцентно мечеными праймерами. Каждый лигированный зонд имеет уникальную длину.

Анализ и интерпретация результатов

Этот этап включает сложную работу по оценке полученных данных, будь то микроскопические изображения или объемные биоинформатические массивы, и их сопоставление с нормальными параметрами.

• Микроскопический анализ (кариотипирование и FISH):
  • Для кариотипирования: Специалист-цитогенетик под микроскопом изучает не менее 20-30 метафазных пластинок, оценивая число и морфологию хромосом. С помощью специализированного программного обеспечения хромосомы сортируются по парам, упорядочиваются по размеру и форме согласно международной номенклатуре (ISCN), формируя кариограмму. Выявляются числовые аномалии и крупные структурные перестройки.
  • Для FISH: Под флуоресцентным микроскопом анализируется количество и расположение флуоресцентных сигналов. Считается не менее 50-100 интерфазных ядер или метафазных пластинок для каждой исследуемой клетки. Наличие или отсутствие сигнала, его количество и расположение указывают на делеции, дупликации, транслокации или анеуплоидии.
• Биоинформатический анализ (aCGH, QF-PCR, MLPA):
  • Для aCGH: После сканирования микроматрицы лазерным сканером, который измеряет интенсивность флуоресценции каждого красителя для каждого зонда, данные обрабатываются специальными программами. Эти программы строят графики соотношения сигналов (ДНК пациента к контрольной ДНК) по всему геному. Отклонения от единицы указывают на участки делеций или дупликаций.
  • Для QF-PCR и MLPA: Амплифицированные фрагменты ДНК анализируются на капиллярном электрофорезе. Программное обеспечение строит профиль пиков, где каждый пик соответствует определенному маркеру или зонду. Сравнение высоты и количества пиков пациента с нормальным контролем позволяет определить число копий исследуемых участков или хромосом.
• Интерпретация: На основе полученных данных специалист проводит интерпретацию, выявляя все отклонения от нормы. Особое внимание уделяется клинической значимости выявленных изменений, их связи с фенотипом пациента и возможным последствиям.

Формирование лабораторного заключения

Финальный этап цитогенетического анализа — это подготовка официального лабораторного заключения, которое является основным документом для врача-клинициста и пациента.

Лабораторное заключение обычно включает следующие элементы:

• Информация о пациенте: ФИО, дата рождения, пол, источник биологического материала.
• Используемый метод исследования: Точное указание применяемого цитогенетического метода (например, кариотипирование, FISH, aCGH, QF-PCR, MLPA) и его разрешающая способность.
• Описание результатов:
  • Для кариотипирования: Полное описание кариотипа в соответствии с международной цитогенетической номенклатурой (ISCN – International System for Human Cytogenomic Nomenclature). Например, 46,XX (нормальный женский кариотип) или 47,XX,+21 (синдром Дауна). При обнаружении структурных перестроек указываются точные точки разрыва и тип перестройки.
  • Для FISH: Количество исследованных ядер/клеток и полученные сигналы для каждого зонда. Например, "два сигнала красного и два сигнала зеленого зонда в 100 интерфазных ядрах" при нормальном результате или "один красный сигнал" при делеции.
  • Для aCGH: Подробное описание всех выявленных несбалансированных изменений числа копий ДНК (делеций и дупликаций), включая их хромосомную локализацию, размер в парах оснований, гены, расположенные в измененных регионах, и ссылки на базы данных (например, OMIM, DECIPHER) для оценки клинической значимости.
  • Для QF-PCR и MLPA: Численные данные, подтверждающие изменение количества копий целевых хромосом или генных локусов.
• Интерпретация клинического значения: Объяснение выявленных аномалий и их потенциального влияния на здоровье пациента. Если обнаружены варианты с неопределенным клиническим значением, это также указывается.
• Рекомендации: При необходимости могут быть даны рекомендации по дальнейшим диагностическим шагам (например, семейный анализ, дополнительные генетические тесты) или направлению к генетическому консультанту.

Важно помнить, что результаты цитогенетического исследования всегда должны интерпретироваться врачом-генетиком в контексте полной клинической картины пациента и его семейного анамнеза. Именно это обеспечивает наиболее точное понимание диагноза и разработку адекватного плана лечения или ведения.

Сравнительная таблица этапов основных цитогенетических методов

Для наглядности, ключевые этапы проведения различных цитогенетических анализов представлены в следующей таблице:

Расшифровка цитогенетических заключений: норма и патологии хромосомного набора

Получение результатов цитогенетического исследования может быть волнительным моментом. Чтобы разобраться в представленных данных, необходимо понимать основные принципы их оформления и интерпретации. Цитогенетическое заключение, как правило, содержит не только выводы о наличии или отсутствии хромосомных аномалий, но и их детальное описание, стандартизированное в соответствии с международными правилами.

Общий формат цитогенетического заключения и его основные элементы

Цитогенетическое заключение представляет собой официальный медицинский документ, содержащий результаты анализа хромосомного набора пациента. Оно оформляется по строгим правилам, чтобы обеспечить однозначную интерпретацию специалистами по всему миру. Формат заключения может незначительно варьироваться между лабораториями, но всегда включает ключевые компоненты.

Типичное цитогенетическое заключение включает следующие разделы:

• Данные пациента: Фамилия, имя, отчество, дата рождения, пол, дата забора образца и дата выдачи заключения.
• Тип исследуемого материала: Указывается, из какого биологического образца проводился анализ (например, периферическая кровь, амниотическая жидкость, ворсины хориона, костный мозг).
• Примененный метод исследования: Точное название цитогенетического метода (например, классическое кариотипирование с G-окрашиванием, FISH-анализ, сравнительная геномная гибридизация на микроматрицах — aCGH, количественная флуоресцентная полимеразная цепная реакция — QF-PCR, мультиплексная лигазная проба на месте — MLPA), его разрешающая способность и используемые зонды, если применимо.
• Количество проанализированных клеток/метафаз: Важный показатель качества и достоверности исследования, особенно для классического кариотипирования и FISH.
• Результат исследования: Основная часть, содержащая формулу кариотипа, описание выявленных изменений (если они есть) и их хромосомную локализацию, часто в соответствии с Международной системой номенклатуры цитогенетических исследований (ISCN).
• Интерпретация: Клиническое объяснение выявленных аномалий, их связь с фенотипом пациента и возможными последствиями. Здесь же могут быть указаны варианты с неопределенным клиническим значением (VOUS).
• Рекомендации: При необходимости даются рекомендации по дальнейшим действиям, таким как проведение дополнительных исследований, семейный анализ или консультация генетика.

Понимание этих элементов является первым шагом к осмыслению полученной информации.

Международная система номенклатуры цитогенетических исследований (ISCN)

Для стандартизации описания хромосомных наборов и их аномалий используется Международная система номенклатуры цитогенетических исследований (ISCN – International System for Human Cytogenomic Nomenclature). Эта система позволяет унифицированно и кратко записывать результаты, делая их понятными для специалистов по всему миру. ISCN-формула является центральной частью любого цитогенетического заключения, описывающей кариотип пациента.

ISCN-формула обычно состоит из следующих компонентов:

1. Общее число хромосом: Первая цифра указывает на общее количество хромосом в клетке.
2. Половые хромосомы: Следующие буквы обозначают набор половых хромосом (XX для женщины, XY для мужчины).
3. Описание аномалий: Далее следуют символы и цифры, детально описывающие выявленные числовые или структурные изменения, включая затронутые хромосомы и точные участки (полосы) на них.

Основные обозначения и символы, используемые в ISCN:

• + (плюс): Дополнительная целая хромосома (например, +21 означает дополнительную 21-ю хромосому).
• - (минус): Отсутствие целой хромосомы (например, -X означает отсутствие одной X-хромосомы).
• del (делеция): Потеря участка хромосомы.
• dup (дупликация): Удвоение участка хромосомы.
• t (транслокация): Перемещение участка хромосомы на другую хромосому.
• inv (инверсия): Поворот участка хромосомы на 180 градусов.
• r (кольцевая хромосома): Хромосома, образовавшая кольцо.
• i (изохромосома): Хромосома, состоящая из двух идентичных плеч.
• p (короткое плечо): Короткое плечо хромосомы.
• q (длинное плечо): Длинное плечо хромосомы.
• (номер_хромосомы): Указывает номер хромосомы, затронутой изменением.
• (регион_плеча): Указывает регион и полосу на плече хромосомы (например, q21 означает регион 2, полосу 1 на длинном плече).
• [количество_клеток] или /: Используется для обозначения мозаицизма, когда в организме присутствуют две или более клеточных линий с разным хромосомным набором.

Понимание этих символов позволяет прочитать "язык" цитогенетики.

Нормальные результаты цитогенетического анализа: что означают "здоровые" хромосомы

Нормальное цитогенетическое заключение свидетельствует об отсутствии видимых на данном уровне разрешения числовых и крупных структурных хромосомных аномалий. Это означает, что кариотип пациента соответствует общепринятым нормам для человека.

Нормальный кариотип описывается следующим образом:

• Для женщины: 46,XX
  • 46 означает, что в каждой клетке обнаружено 46 хромосом.
  • XX указывает на наличие двух X-хромосом, что является нормой для женского пола.
• Для мужчины: 46,XY
  • 46 означает, что в каждой клетке обнаружено 46 хромосом.
  • XY указывает на наличие одной X-хромосомы и одной Y-хромосомы, что является нормой для мужского пола.

Получение нормального заключения по классическому кариотипированию или другим цитогенетическим методам говорит о том, что крупные хромосомные перестройки, являющиеся причиной многих врожденных синдромов, не выявлены. Однако важно помнить, что нормальный цитогенетический анализ не исключает наличие микроскопических аномалий (которые могут быть обнаружены только методами с более высоким разрешением, такими как aCGH), а также генных мутаций, не затрагивающих структуру хромосом (например, точечных мутаций), для выявления которых требуются молекулярно-генетические исследования.

Интерпретация патологических результатов: числовые аномалии хромосом

Числовые аномалии хромосом, или анеуплоидии, возникают при изменении нормального количества хромосом в клетке. Эти изменения часто имеют серьезные клинические последствия и являются причиной многих известных генетических синдромов.

Основные типы числовых аномалий и их ISCN-обозначения:

Выявление числовых аномалий подтверждает диагноз соответствующего синдрома. Мозаицизм означает, что не все клетки организма несут аномалию, что может влиять на степень выраженности клинических симптомов.

Интерпретация патологических результатов: структурные аномалии хромосом

Структурные аномалии хромосом возникают при изменениях в строении одной или нескольких хромосом. Они могут быть сбалансированными, когда генетический материал не теряется и не дуплицируется, а лишь перераспределяется, или несбалансированными, когда происходит потеря или избыток генетического материала. Клинические последствия зависят от типа и размера перестройки, а также от того, является ли она сбалансированной.

Основные типы структурных аномалий и их ISCN-обозначения:

Идентификация структурных аномалий требует высокой квалификации специалиста и часто является причиной для углубленного генетического консультирования, особенно при сбалансированных перестройках у фенотипически здоровых носителей, которые могут иметь риски для потомства.

Расшифровка результатов молекулярно-цитогенетических методов (FISH, aCGH, QF-PCR, MLPA)

Молекулярно-цитогенетические методы, такие как FISH, aCGH, QF-PCR и MLPA, предоставляют более детальную информацию о хромосомных аномалиях, чем классическое кариотипирование, особенно в случаях микроделеций, микродупликаций и специфических генных перестроек. Интерпретация их результатов имеет свои особенности.

• Метод FISH (флуоресцентная гибридизация на месте):

  В заключении по FISH указывается тип использованного зонда (например, центромерный, локус-специфичный, теломерный) и количество флуоресцентных сигналов в исследованных ядрах или метафазах. Нормальным считается наличие двух сигналов для аутосомных зондов и соответствующее количество для половых хромосом (например, один X и один Y сигнал для мужчины). Отсутствие сигнала указывает на делецию, а наличие трех или более сигналов — на дупликацию или трисомию. Например, ish del(22)(q11.2q11.2) будет указывать на делецию в регионе 22q11.2, характерную для синдрома Ди Джорджи.

• Сравнительная геномная гибридизация на микроматрицах (aCGH):

  Результаты aCGH представляются в виде графиков, где отклонения от базовой линии указывают на изменения числа копий ДНК. В заключении указываются хромосомные координаты выявленных делеций (потери генетического материала) или дупликаций (избытка генетического материала), их размер в килобазах (кб) или мегабазах (Мб), а также список генов, расположенных в этих измененных регионах. Например, arr[hg19] 22q11.21(18,890,000-19,340,000)x1 означает делецию в регионе 22q11.21 на одной из двух хромосом (уменьшение числа копий до 1), с указанием точных координат по геномной сборке hg19. Этот метод часто выявляет варианты числа копий (CNV), которые могут иметь неопределенное клиническое значение (VOUS).

• Количественная флуоресцентная полимеразная цепная реакция (QF-PCR):

  Заключение QF-PCR содержит данные об анализе STR-маркеров на интересующих хромосомах (чаще 13, 18, 21, X, Y). Нормальный результат показывает наличие двух аллелей (пиков) с равной интенсивностью или одного аллеля с удвоенной интенсивностью. При трисомии будут обнаружены либо три разных аллеля (три пика), либо два аллеля с соотношением интенсивностей 2:1 (один аллель в двух копиях, другой — в одной), либо один аллель с утроенной интенсивностью. Эти данные позволяют быстро диагностировать распространенные анеуплоидии. Например, при трисомии 21 можно увидеть "три аллеля маркера D21S11" или "соотношение 2:1 для маркера D21S1446".

• Мультиплексная лигазная проба на месте (MLPA):

  Результаты MLPA выражаются в виде отношения интенсивности сигналов зондов пациента к контрольному образцу. Нормальное соотношение близко к 1. Снижение соотношения (например, до 0,5) указывает на делецию целевого участка, а увеличение (например, до 1,5) — на дупликацию. В заключении MLPA будет указан конкретный набор зондов (например, MLPA P123-A2 для синдрома Ди Джорджи) и номера экзонов/генов, в которых выявлены изменения числа копий. Например, "делеция экзонов 1-5 гена DMD" или "дупликация региона 7q11.23".

Высокая разрешающая способность этих методов позволяет выявлять субмикроскопические изменения, которые могут быть причиной заболеваний даже при нормальном кариотипе.

Варианты с неопределенным клиническим значением (VOUS): что делать с "неясными" находками

С развитием высокоразрешающих методов, таких как сравнительная геномная гибридизация на микроматрицах (aCGH), все чаще обнаруживаются так называемые варианты числа копий (CNV) или другие изменения, клиническое значение которых на момент исследования не до конца ясно. Такие находки обозначаются как варианты с неопределенным клиническим значением (VOUS — Variant of Uncertain Significance).

Появление VOUS обусловлено несколькими факторами:

• Высокая разрешающая способность: Современные методы способны выявлять очень мелкие изменения, которые не были видны ранее и о клинической роли которых еще недостаточно накоплено данных.
• Индивидуальная вариабельность генома: Геном каждого человека уникален и содержит множество мелких, обычно безвредных вариаций, которые могут быть расценены как VOUS.
• Недостаток данных: Для некоторых редких CNV недостаточно информации в научных базах данных или публикациях, чтобы однозначно отнести их к патогенным или доброкачественным.

Обнаружение VOUS может вызвать тревогу у пациента, поскольку оно оставляет некоторую неопределенность в диагнозе. В таких ситуациях крайне важно дальнейшее консультирование с генетиком.

Рекомендации по ведению и интерпретации VOUS:

• Семейный анализ: Проведение цитогенетического исследования у родителей пациента (или других близких родственников) для выяснения, унаследован ли вариант от одного из здоровых родителей или он возник впервые. Если вариант унаследован от здорового родителя, это значительно снижает вероятность его патогенности.
• Поиск в базах данных: Генетик может обратиться к специализированным базам данных (например, DECIPHER, ClinGen), которые агрегируют информацию о CNV и их клинических ассоциациях.
• Повторная оценка: С течением времени и накоплением новых научных данных статус VOUS может быть пересмотрен на доброкачественный или патогенный. Поэтому важно сохранять заключение и периодически консультироваться с генетиком.
• Клиническая корреляция: Сопоставление выявленного варианта с клинической картиной пациента. Иногда даже небольшие изменения могут быть важными, если они затрагивают критические гены или расположены в клинически значимых регионах.

Варианты с неопределенным клиническим значением требуют тщательной оценки и комплексного подхода. Они подчеркивают важность непрерывного взаимодействия пациента и его семьи с врачом-генетиком.

Значение генетического консультирования после получения заключения

Цитогенетическое заключение, особенно если оно содержит информацию об аномалиях или вариантах с неопределенным клиническим значением, является сложным медицинским документом. Самостоятельная интерпретация результатов без специализированных знаний может привести к неправильным выводам и излишней тревоге. Поэтому консультация врача-генетика после получения заключения является обязательным этапом.

Основные задачи генетического консультирования:

• Разъяснение результатов: Генетик подробно объяснит, что означает формула кариотипа, какие аномалии были выявлены, или почему некоторые находки классифицируются как VOUS. Специалист переведет сложную медицинскую терминологию на понятный язык.
• Объяснение клинических последствий: Будут разъяснены возможные проявления и последствия выявленной аномалии для здоровья пациента, его развития и прогноза.
• Оценка рисков для потомства: Для носителей сбалансированных хромосомных перестроек генетик оценит риски рождения детей с несбалансированными хромосомными аномалиями и обсудит возможные репродуктивные стратегии (например, пренатальная диагностика, преимплантационная генетическая диагностика).
• Составление индивидуального плана действий: Генетик может рекомендовать дополнительные обследования, консультации других специалистов (невролога, эндокринолога, кардиолога) или специализированные программы поддержки и реабилитации.
• Психологическая поддержка: Получение информации о генетической аномалии может быть эмоционально тяжелым. Генетик поможет справиться с этой информацией, предоставит необходимую поддержку и информацию о группах поддержки.

Генетическое консультирование обеспечивает не только полное понимание диагноза, но и помогает принять обоснованные решения относительно дальнейшего ведения, планирования семьи и улучшения качества жизни пациента и его близких.

Значение цитогенетических исследований для генетического консультирования и репродуктивного здоровья

Цитогенетические исследования играют центральную роль в генетическом консультировании и репродуктивной медицине, предоставляя критически важную информацию для понимания наследственных заболеваний, оценки репродуктивных рисков и принятия обоснованных решений относительно планирования семьи. Результаты анализа хромосом позволяют не только подтвердить диагноз, но и определить вероятность передачи аномалий потомству, что является краеугольным камнем для индивидуального подхода в каждом клиническом случае.

Роль цитогенетических исследований в генетическом консультировании

Генетическое консультирование представляет собой процесс, в ходе которого специалисты предоставляют пациентам и их семьям информацию о генетических заболеваниях, рисках их возникновения, методах диагностики и доступных стратегиях управления. Цитогенетические исследования являются фундаментом для этого процесса, поскольку именно они позволяют выявить хромосомные аномалии, лежащие в основе многих наследственных синдромов и репродуктивных проблем.

Благодаря данным цитогенетического анализа, генетик может:

• Установить точный диагноз: Подтверждение или исключение хромосомной аномалии у пациента с клиническими признаками позволяет определить специфический синдром (например, синдром Дауна, синдром Ди Джорджи) и начать соответствующее лечение или реабилитацию.
• Оценить риски повторения: Если у пациента или в его семье уже есть ребенок с хромосомной патологией, или у родителей выявлены сбалансированные хромосомные перестройки, цитогенетические данные позволяют точно рассчитать риск рождения еще одного ребенка с аналогичной аномалией для будущих беременностей.
• Объяснить природу заболевания: пациенты и их семьи получают полное понимание генетической причины состояния, что помогает им лучше ориентироваться в ситуации и принять информацию.
• Разработать план ведения и профилактики: В зависимости от выявленной аномалии, генетик может рекомендовать специфические медицинские обследования, консультации узких специалистов, образовательные программы или поддерживающую терапию.
• Предложить варианты планирования семьи: При повышенных рисках рождения больного ребенка генетик информирует о таких возможностях, как пренатальная диагностика, преимплантационная генетическая диагностика (ПГД), использование донорских гамет или усыновление.

Таким образом, цитогенетические исследования трансформируют неопределенность в конкретные данные, что дает возможность семьям принимать обоснованные и обдуманные решения.

Цитогенетика в репродуктивной медицине: диагностика бесплодия и невынашивания

Репродуктивные проблемы, такие как бесплодие, привычное невынашивание беременности (два и более самопроизвольных прерывания беременности) и рождение детей с множественными пороками развития, часто имеют хромосомные причины. Цитогенетические методы исследования являются незаменимым инструментом в выявлении этих причин у обоих партнеров.

Ключевые аспекты применения цитогенетики в репродуктивной медицине:

• Выявление сбалансированных хромосомных перестроек: У многих пар с бесплодием или привычным невынашиванием беременности, несмотря на нормальный фенотип (внешний вид и здоровье), цитогенетическое кариотипирование обнаруживает сбалансированные транслокации или инверсии. Эти перестройки не вызывают проблем у носителя, так как весь генетический материал присутствует, но его расположение изменено. Однако при формировании гамет (сперматозоидов и яйцеклеток) у таких носителей высока вероятность образования несбалансированных хромосом, что приводит к:
  • Невозможность зачатия (бесплодие).
  • Ранние выкидыши из-за нежизнеспособности эмбрионов с несбалансированным хромосомным набором.
  • Рождение детей с тяжелыми генетическими синдромами и пороками развития.
• Анализ анеуплоидий половых хромосом: У мужчин с бесплодием цитогенетический анализ может выявить синдром Клайнфельтера (кариотип 47,XXY) или другие аномалии половых хромосом, которые являются причиной азооспермии (отсутствия сперматозоидов) или олигозооспермии (снижения их количества). У женщин с бесплодием или преждевременным истощением яичников могут быть обнаружены аномалии X-хромосомы, такие как синдром Шерешевского-Тернера (кариотип 45,X) или различные мозаичные формы.
• Исследование абортивного материала: Цитогенетический анализ тканей плода после самопроизвольного прерывания беременности позволяет установить причину невынашивания. До 50-70% ранних выкидышей связаны с хромосомными аномалиями, чаще всего анеуплоидиями. Эта информация критически важна для дальнейшего планирования беременности.

После выявления хромосомных аномалий у одного из партнеров, генетик может рекомендовать специфические репродуктивные стратегии, такие как экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) с преимплантационной генетической диагностикой.

Преимплантационная и пренатальная диагностика: планирование здоровой беременности

Для пар с высоким риском рождения ребенка с хромосомными аномалиями современные цитогенетические методы предлагают эффективные пути для обеспечения здоровой беременности через преимплантационную и пренатальную диагностику.

Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) и скрининг (ПГС)

Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД), теперь чаще называемая преимплантационным генетическим тестированием на структурные перестройки (PGT-SR) или на анеуплоидии (PGT-A), проводится в рамках программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Этот метод позволяет анализировать хромосомный набор эмбрионов до их имплантации в матку.

• PGT-SR: Применяется для пар, у одного из которых выявлены сбалансированные хромосомные перестройки (транслокации, инверсии). Цель — отобрать эмбрионы с нормальным или сбалансированным хромосомным набором, исключив эмбрионы с несбалансированными аномалиями, которые могут привести к невынашиванию или рождению больного ребенка.
• PGT-A: Используется для скрининга эмбрионов на анеуплоидии (числовые аномалии хромосом, такие как трисомии или моносомии). Это особенно актуально для женщин старшего репродуктивного возраста, при повторяющихся неудачах ЭКО, привычном невынашивании беременности или при наличии предыдущих беременностей с анеуплоидиями.

Методы, используемые для PGT-SR/PGT-A, включают сравнительную геномную гибридизацию на микроматрицах (aCGH), секвенирование нового поколения (NGS), которые позволяют анализировать весь хромосомный набор эмбриональных клеток с высоким разрешением.

Пренатальная диагностика

Пренатальная диагностика направлена на выявление хромосомных аномалий у плода во время беременности. Она рекомендуется при наличии факторов риска, таких как повышенный возраст матери, аномальные результаты скрининга у беременных, ультразвуковые маркеры хромосомной патологии, или если родители являются носителями сбалансированных хромосомных перестроек.

Основные методы пренатальной цитогенетической диагностики включают:

• Амниоцентез: Забор околоплодной жидкости с последующим цитогенетическим анализом клеток плода (кариотипирование, флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), aCGH, количественная флуоресцентная полимеразная цепная реакция (QF-PCR)).
• Биопсия ворсин хориона: Забор ткани плаценты с последующим анализом клеток плода (кариотипирование, флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), aCGH, количественная флуоресцентная полимеразная цепная реакция (QF-PCR)).
• Неинвазивный пренатальный тест (НИПТ): анализ свободно циркулирующей фетальной ДНК в крови матери. Хотя НИПТ не является цитогенетическим методом в прямом смысле, он использует молекулярные подходы для скрининга наиболее частых анеуплоидий (трисомии 13, 18, 21 и аномалии половых хромосом) и является важным этапом в цепочке пренатальной диагностики, часто предшествующим инвазивным методам.

Результаты пренатальной диагностики позволяют родителям получить точную информацию о здоровье плода и принять информированное решение о дальнейшей тактике ведения беременности.

Принятие информированных решений на основе цитогенетических данных

Информация, полученная в ходе цитогенетических исследований, наделяет пациентов и семьи возможностью принимать осознанные решения, которые влияют на их репродуктивное здоровье, семейное планирование и будущее детей. Этот процесс принятия решений всегда сопровождается генетическим консультированием, где обсуждаются все возможные варианты.

Важные аспекты, которые обсуждаются с семьями:

• Понимание рисков и вероятностей: Генетик разъясняет, что означают конкретные результаты, какова вероятность повторения аномалии в будущих беременностях и какие факторы могут на это влиять. Например, для носителей сбалансированных транслокаций риски могут быть значительно выше, чем для общей популяции.
• Выбор репродуктивных стратегий: Пары могут выбрать между естественным зачатием с пренатальной диагностикой, экстракорпоральным оплодотворением (ЭКО) с преимплантационной генетической диагностикой (PGT-SR/PGT-A), использованием донорских гамет или усыновлением. Каждая стратегия имеет свои преимущества, недостатки и этические соображения, которые подробно обсуждаются.
• Подготовка к рождению ребенка с особенностями развития: Если пренатальная диагностика выявила хромосомную аномалию, и семья принимает решение сохранить беременность, генетическое консультирование помогает подготовиться к рождению ребенка с особыми потребностями. Это включает информирование о возможных медицинских проблемах, доступных программах поддержки, реабилитации и паллиативной помощи.
• Психосоциальная поддержка: Информация о генетической аномалии может быть эмоционально тяжелой. Генетическое консультирование часто включает элементы психологической поддержки, помогая семьям справиться с новостью, обсудить их опасения и страхи, а также направить их к группам поддержки или психологам.
• Долгосрочное планирование: В некоторых случаях, например, при выявлении носительства сбалансированной транслокации, рекомендации могут касаться и более широкого круга родственников, предлагая им также пройти цитогенетическое обследование для оценки их репродуктивных рисков.

Таким образом, цитогенетические исследования не только диагностируют состояние, но и служат основой для комплексного подхода к управлению генетическим здоровьем семьи, обеспечивая им максимально полную и точную информацию для осознанного выбора.

Резюме значения цитогенетических методов

В следующей таблице обобщены ключевые аспекты значения цитогенетических исследований для генетического консультирования и репродуктивного здоровья.

Ограничения цитогенетических методов и перспективы развития генетической диагностики

Несмотря на значительную диагностическую ценность, все цитогенетические методы обладают присущими им ограничениями. Эти ограничения часто обусловлены техническим разрешением метода, его целевым характером или специфическим типом генетических изменений, которые он предназначен выявлять.

Общие ограничения цитогенетических методов исследования

Цитогенетическая диагностика, являясь краеугольным камнем в выявлении хромосомных аномалий, имеет свои пределы, преодоление которых является задачей современной генетической науки.

• Невозможность выявления точковых мутаций: Цитогенетические методы, включая классическое кариотипирование, флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH), сравнительную геномную гибридизацию на микроматрицах (aCGH), количественную флуоресцентную полимеразную цепную реакцию (QF-PCR) и мультиплексную лигазную пробу на месте (MLPA), ориентированы на обнаружение изменений в числе или структуре хромосом, а также их сегментов. Они не способны выявлять изменения на уровне одного или нескольких нуклеотидов (точковые мутации), малые инсерции или делеции внутри одного гена. Такие мутации, являющиеся причиной большинства моногенных заболеваний (например, муковисцидоз, фенилкетонурия, спинальная мышечная атрофия), требуют молекулярно-генетических методов, таких как секвенирование ДНК.
• Ограниченное разрешение для мелких изменений: Классическое кариотипирование имеет наименьшее разрешение (5-10 миллионов пар оснований), не позволяя обнаружить микроделеции и микродупликации, которые меньше этого порога. Хотя молекулярно-цитогенетические методы значительно повышают разрешающую способность, они всё равно имеют предел. Например, aCGH может пропустить очень маленькие изменения, не покрытые зондами на микроматрице, или изменения, находящиеся в областях с низкой плотностью зондов.
• Неэффективность в диагностике сбалансированных хромосомных перестроек (для некоторых методов): Сравнительная геномная гибридизация (CGH и aCGH), QF-PCR и MLPA не могут выявить сбалансированные транслокации или инверсии. Эти перестройки не сопровождаются изменением общего количества генетического материала, что является основным принципом детекции для указанных методов. Сбалансированные перестройки могут быть обнаружены только классическим кариотипированием или специфическими FISH-зондами, охватывающими точки разрыва.
• Ограниченное обнаружение низкоуровневого мозаицизма: Все цитогенетические методы имеют порог чувствительности к мозаицизму (присутствие нескольких клеточных линий с разным набором хромосом). Если аномальная клеточная линия присутствует в слишком малом проценте клеток (например, менее 5-10% для FISH и кариотипирования, 10-20% для aCGH/MLPA), она может быть не обнаружена. Это может привести к ложноотрицательному результату при реальном наличии патологии.
• Выявление вариантов с неопределенным клиническим значением (VOUS): С ростом разрешающей способности методов, особенно aCGH, увеличивается число обнаруженных изменений числа копий ДНК (CNV), клиническая значимость которых на момент исследования неизвестна. Это может создавать сложности в интерпретации результатов, вызывать тревогу у пациентов и требовать дополнительных исследований для уточнения.
• Требование к качеству и количеству ДНК/клеток: Для всех методов требуется достаточное количество качественного биологического материала. Деградированная ДНК или недостаточная клеточная масса могут сделать анализ невозможным или снизить его достоверность, что особенно актуально для биоптатов опухолей или образцов после гибели плода.

Сравнительный анализ ограничений различных цитогенетических методов

Для более полного понимания диагностических пределов важно рассмотреть основные ограничения каждого цитогенетического метода в сравнении:

Перспективы развития генетической диагностики: новые горизонты

Генетическая диагностика непрерывно развивается, и на смену традиционным цитогенетическим методам приходят новые технологии, предлагающие более высокую разрешающую способность, скорость и объем анализируемой информации. Эти достижения открывают новые возможности для точной диагностики сложных генетических заболеваний.

• Секвенирование нового поколения (NGS):

  NGS, также известное как высокопроизводительное секвенирование, стало прорывной технологией, позволяющей анализировать миллионы фрагментов дезоксирибонуклеиновой кислоты одновременно. Это дает возможность детально изучать генетический материал с беспрецедентной точностью. Методы NGS включают:

  • Полноэкзомное секвенирование (WES): Этот метод анализирует все кодирующие участки генов (экзоны), которые составляют около 1-2% генома, но содержат до 85% известных патогенных мутаций. WES позволяет выявлять точковые мутации, мелкие инсерции/делеции и изменения числа копий в экзонных областях, которые недоступны цитогенетическим методам.
  • Полногеномное секвенирование (WGS): Этот метод анализирует весь геном человека, включая кодирующие и некодирующие области. WGS позволяет обнаружить не только точковые мутации и мелкие изменения, но и большинство структурных перестроек, включая сбалансированные транслокации, инверсии и вариации числа копий ДНК, которые могут быть пропущены aCGH или FISH. WGS предлагает наиболее полное генетическое исследование на сегодняшний день.
  • Секвенирование панелей генов: Это целевое секвенирование группы генов, связанных с конкретным заболеванием или группой заболеваний. Данный подход более экономичен и быстр, чем WES или WGS, если клиническое подозрение указывает на определенную патологию.

  NGS-технологии обладают потенциалом для выявления множества типов генетических аномалий, от точковых мутаций до крупных структурных перестроек, что делает их мощным инструментом в диагностике и исследованиях.

• Оптическое картирование генома (OGM):

  OGM — это новый метод, который позволяет напрямую визуализировать сверхдлинные молекулы ДНК (сотни тысяч и миллионы пар оснований) и выявлять крупные структурные вариации генома (размером от нескольких кб до Мб), включая сбалансированные и несбалансированные транслокации, инверсии, делеции, дупликации. OGM не зависит от полимеразной цепной реакции и секвенирования, что позволяет обнаруживать сложные перестройки, которые трудно или невозможно выявить другими методами, включая NGS в некоторых случаях. Этот метод особенно перспективен для диагностики причин задержек развития, неясных фенотипов и онкологических заболеваний.

• Усовершенствованные биоинформатические инструменты и искусственный интеллект (ИИ):

  С развитием высокопроизводительных методов генерируется огромный объем данных. Биоинформатика и искусственный интеллект играют решающую роль в их анализе и интерпретации. ИИ-системы способны выявлять закономерности в геномных данных, предсказывать патогенность вариантов, интегрировать клинические и генетические данные для более точной диагностики и даже обнаруживать новые генетические ассоциации с заболеваниями. Это значительно ускоряет и повышает эффективность генетической диагностики.

• Единая платформа для комплексного анализа:

  Перспективы развития также включают создание интегрированных диагностических платформ, которые позволят одновременно анализировать различные типы генетических аномалий — от точковых мутаций до крупных хромосомных перестроек — с использованием одного образца и на одной платформе. Это упростит диагностический процесс, сократит время получения результатов и повысит общую эффективность исследований.

Интеграция методов: синергия для точной диагностики

Будущее генетической диагностики видится не в замене одних методов другими, а в их комплексной интеграции. Сочетание различных цитогенетических и молекулярно-генетических подходов позволяет максимально полно и точно исследовать геном человека, перекрывая ограничения каждого отдельного метода. Это обеспечивает более глубокое понимание генетической природы заболевания и минимизирует количество неясных диагностических случаев.

Примеры интеграции включают:

• Комбинированное использование aCGH и WES/WGS: Сравнительная геномная гибридизация на микроматрицах эффективно выявляет изменения числа копий ДНК, тогда как полноэкзомное или полногеномное секвенирование фокусируется на точковых мутациях и мелких инсерциях/делециях. Их совместное применение обеспечивает более полное покрытие генома и выявление широкого спектра патологий.
• FISH для подтверждения: После обнаружения аномалии методом aCGH или NGS, флуоресцентная гибридизация in situ может быть использована для подтверждения конкретной перестройки в тканях или при низком уровне мозаицизма, обеспечивая дополнительную визуализацию.
• Применение OGM для сложных структурных перестроек: В случаях, когда полногеномное секвенирование не дает однозначного ответа о крупных и сложных структурных аномалиях, оптическое картирование генома может предоставить решающую информацию, позволяя детализировать перестройки, не поддающиеся другим методам.

Такой синергетический подход позволяет минимизировать количество "неясных" случаев и повысить диагностический выход, обеспечивая наиболее точное понимание генетической основы здоровья и болезни. Это крайне важно для пациентов, особенно тех, кто долгое время не может получить точный диагноз. Современные достижения в генетической диагностике постоянно расширяют наши возможности, предлагая все более точные и быстрые методы исследования.

Список литературы

1. Shaffer L.G., McGowan-Jordan J., Schmid M. (Eds.). An International System for Human Cytogenomic Nomenclature (2020). — Basel: Karger, 2020.
2. Бочков Н.П. Клиническая генетика: учебник. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011.
3. Nussbaum R.L., McInnes R.R., Willard H.F. Thompson & Thompson Genetics in Medicine. 9th ed. — Philadelphia: Elsevier, 2016.
4. Gardner R.J.M., Sutherland G.R., Shaffer L.G. Chromosome Abnormalities and Genetic Counseling. 5th ed. — Oxford: Oxford University Press, 2018.
5. Медицинская генетика: национальное руководство / под ред. Е.К. Гинтера. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2020.