Капиллярный электрофорез для точного генетического анализа по Сэнгеру

Капиллярный электрофорез для точного генетического анализа по Сэнгеру — это ключевой лабораторный метод, который позволяет с высочайшей точностью «прочитать» последовательность определенного участка ДНК. На протяжении многих лет он остается «золотым стандартом» для подтверждения генетических мутаций, отвечающих за развитие многих наследственных заболеваний. Этот подход незаменим, когда врачу необходимо получить предельно достоверную информацию о конкретном гене, чтобы поставить окончательный диагноз, определить носительство или спланировать ведение пациента.

Что такое секвенирование по Сэнгеру и почему оно считается «золотым стандартом»

Секвенирование по Сэнгеру представляет собой метод определения точной последовательности нуклеотидов — «букв» (А, Т, Г, Ц), из которых состоит ДНК. Суть метода заключается в создании множества копий исследуемого фрагмента ДНК, причем каждая копия обрывается на определенном нуклеотиде. Для этого используются специальные, химически модифицированные нуклеотиды, которые останавливают дальнейшее достраивание цепи. Каждый из четырех типов таких «терминирующих» нуклеотидов помечен своим флуоресцентным красителем.

Почему же этот метод получил статус «золотого стандарта»? Главная причина — его исключительная точность. В отличие от более массовых методов, которые анализируют геном целиком или большими частями, секвенирование по Сэнгеру нацелено на один конкретный, заранее выбранный участок. Это позволяет многократно и с минимальной погрешностью прочитать каждую «букву» в этом фрагменте. Такая прицельная точность критически важна для клинической генетики, где ошибка всего в одном нуклеотиде может полностью изменить диагноз и дальнейшую тактику ведения пациента. Метод позволяет избежать ложноположительных и ложноотрицательных результатов, которые могут возникать при использовании скрининговых технологий.

Роль капиллярного электрофореза в методе Сэнгера

Если секвенирование по Сэнгеру — это способ подготовить меченые фрагменты ДНК разной длины, то капиллярный электрофорез (КЭ) — это инструмент, который их сортирует и «считывает». Без этого этапа результаты реакции Сэнгера остались бы просто смесью молекул в пробирке. Процесс анализа происходит внутри тончайшей стеклянной трубки — капилляра, заполненного специальным гелем-полимером.

Принцип работы капиллярного электрофореза основан на том, что молекулы ДНК имеют отрицательный заряд. Когда на концы капилляра подается электрическое напряжение, фрагменты ДНК начинают двигаться от отрицательного полюса к положительному. Гель внутри капилляра действует как сито: короткие фрагменты движутся сквозь него быстрее, а длинные — медленнее. Таким образом, молекулы разделяются по длине с точностью до одного нуклеотида.

В конце капилляра расположен лазерный детектор. Когда очередной фрагмент ДНК проходит через луч лазера, его флуоресцентная метка начинает светиться определенным цветом. Компьютер регистрирует этот цвет и порядок, в котором метки достигают детектора. На основе этих данных строится специальный график — электрофореграмма. На ней каждый нуклеотид представлен пиком своего цвета (например, зеленый для А, синий для Ц, черный для Г и красный для Т). Анализируя последовательность этих цветных пиков, специалист восстанавливает исходную последовательность ДНК исследуемого гена.

Этапы генетического анализа: от взятия образца до результата

Для пациента весь процесс генетического анализа выглядит достаточно просто, однако за ним стоит сложная и высокотехнологичная работа лаборатории. Понимание этих этапов помогает снять тревогу и дает представление о том, что происходит с вашим биологическим материалом.

• Консультация врача-генетика. Это первый и самый важный шаг. Врач определяет, какой именно ген или участок гена необходимо исследовать, исходя из клинической картины, семейной истории и других данных.
• Взятие биологического материала. Чаще всего для анализа используется венозная кровь. В некоторых случаях может использоваться буккальный эпителий (соскоб с внутренней стороны щеки) или слюна. Процедура взятия материала стандартна и безопасна.
• Выделение ДНК в лаборатории. Из полученного образца лаборанты-генетики с помощью специальных наборов реагентов выделяют чистую ДНК, которая и будет служить матрицей для дальнейшего анализа.
• Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Перед секвенированием нужный участок ДНК необходимо «размножить» — получить миллионы его копий. Это делается с помощью метода ПЦР. Большое количество копий обеспечивает достаточную чувствительность анализа.
• Секвенирующая реакция. На этом этапе проводится непосредственно реакция по методу Сэнгера, в результате которой образуются меченые флуоресцентными красителями фрагменты ДНК разной длины.
• Капиллярный электрофорез. Подготовленная смесь фрагментов загружается в прибор — генетический анализатор (секвенатор), где происходит их разделение и детекция.
• Анализ данных и формирование заключения. Специальная программа обрабатывает полученные данные и строит электрофореграмму. Врач-лабораторный генетик внимательно изучает ее, сравнивает с эталонной последовательностью гена (референсной) и выявляет любые отличия (мутации). На основе этого анализа формируется медицинское заключение.

Когда назначают секвенирование по Сэнгеру с использованием КЭ

Этот метод не используется для массового скрининга всего генома. Это высокоточный инструмент для решения конкретных клинических задач. Врач может порекомендовать данный анализ в следующих ситуациях.

• Подтверждение мутаций. Если в результате широкого генетического скрининга, например секвенирования нового поколения (NGS), был выявлен клинически значимый вариант, его обязательно нужно подтвердить «золотым стандартом» — секвенированием по Сэнгеру.
• Диагностика моногенных заболеваний. При подозрении на заболевание, вызванное мутацией в одном конкретном гене (например, муковисцидоз, фенилкетонурия, гемофилия, синдром Марфана), прицельное секвенирование этого гена является основным методом диагностики.
• Поиск известных семейных мутаций. Если у кого-то из кровных родственников уже была выявлена конкретная мутация, вызывающая заболевание, другим членам семьи можно провести таргетный анализ именно на наличие этого варианта. Это быстрее и дешевле, чем полногеномные исследования.
• Анализ небольших генов или отдельных участков генов. Когда область поиска мутации четко определена и невелика, секвенирование по Сэнгеру является наиболее рациональным и экономически эффективным методом.

Сравнение секвенирования по Сэнгеру и секвенирования нового поколения (NGS)

Пациенты часто спрашивают, какой метод лучше — классический по Сэнгеру или более современный NGS. Важно понимать, что это не конкурирующие, а взаимодополняющие технологии. У каждой из них своя область применения и свои сильные стороны. Выбор метода зависит от клинической задачи.

Ниже представлена таблица, которая наглядно сравнивает два этих подхода.

Можно провести аналогию: секвенирование по Сэнгеру — это снайперская винтовка, которая бьет точно в одну цель, а NGS — это спутниковая съемка, которая позволяет охватить огромную территорию. Выбор «оружия» зависит от поставленной боевой задачи.

Как интерпретировать результаты и что делать дальше

Получив на руки заключение, пациент видит не просто набор букв, а вывод специалиста. Результаты могут быть нескольких типов, и важно понимать, что они означают. Окончательную интерпретацию всегда проводит врач-генетик с учетом всех клинических данных.

• Патогенный вариант не обнаружен. Это означает, что в исследованном участке гена не найдено мутаций, которые известны науке как вызывающие заболевание. Это снижает вероятность диагноза, но не исключает его на 100%, так как причина может быть в другом гене или в еще не описанной мутации.
• Обнаружен патогенный/вероятно патогенный вариант. Это означает, что найдена мутация, которая с высокой долей вероятности является причиной заболевания. Такой результат позволяет поставить окончательный диагноз.
• Обнаружен вариант с неизвестной клинической значимостью (VUS). Это наиболее сложная для интерпретации ситуация. Найдено изменение в последовательности ДНК, но на сегодняшний день у науки недостаточно данных, чтобы однозначно сказать, вызывает ли оно заболевание или является безвредной индивидуальной особенностью. В таком случае может потребоваться дополнительное обследование, в том числе и родственников.

Независимо от полученного результата, самый главный и правильный следующий шаг — это повторная консультация с врачом-генетиком. Только специалист сможет грамотно соотнести данные генетического анализа с клинической картиной, объяснить их значение для вас и вашей семьи, а также составить план дальнейших действий, который может включать рекомендации по лечению, наблюдению или профилактике.

Список литературы

1. Гинтер Е.К. Медицинская генетика: Учебник. — М.: Медицина, 2003. — 448 с.
2. Бочков Н.П. Клиническая генетика: Учебник. — 4-е изд., доп. и перераб. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. — 592 с.
3. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / под ред. С. Херрингтона, Дж. Макги; пер. с англ. под ред. В.Л. Мельникова. — М.: Мир, 1999. — 558 с.
4. Nussbaum R.L., McInnes R.R., Willard H.F. Thompson & Thompson Genetics in Medicine. 8th Edition. — Elsevier, 2016. — 544 p.
5. Strachan T., Read A.P. Human Molecular Genetics. 4th Edition. — Garland Science, 2010. — 784 p.
6. Муковисцидоз. Клинические рекомендации РФ. — Министерство здравоохранения Российской Федерации, 2021.