Роль полимеразной цепной реакции (ПЦР) в методе Сэнгера

Роль полимеразной цепной реакции (ПЦР) в методе Сенгера заключается в подготовке и многократном увеличении количества (амплификации) конкретного участка ДНК, который необходимо проанализировать. Метод Сенгера, являясь «золотым стандартом» для точного определения последовательности нуклеотидов, требует для своей работы значительного количества идентичных копий исследуемого фрагмента. Полимеразная цепная реакция выступает в качестве незаменимого инструмента, который позволяет получить этот необходимый материал из минимального исходного образца, делая последующее секвенирование возможным и высокоточным.

Почему метод Сенгера не обходится без предварительной подготовки ДНК

Секвенирование по Сенгеру — это метод, который позволяет «прочитать» точную последовательность генетического кода в определенном фрагменте ДНК. Однако он имеет важное ограничение: для надежного результата ему требуется большое количество чистого и однородного генетического материала. В исходном биологическом образце (например, в капле крови или соскобе клеток) интересующий нас ген или его участок присутствует в ничтожно малом количестве по сравнению со всей остальной ДНК. Попытка провести секвенирование напрямую из такого образца подобна попытке прочитать одну страницу в огромной библиотеке, где все страницы перемешаны. Результат будет нечитаемым «шумом». Именно эту проблему и решает полимеразная цепная реакция.

ПЦР позволяет избирательно «найти» нужный фрагмент ДНК и создать миллионы его точных копий. Этот процесс можно сравнить с созданием множества ксерокопий одной и той же страницы из библиотечной книги. В итоге мы получаем достаточное количество материала, чтобы секвенатор (прибор для секвенирования) смог безошибочно определить последовательность, игнорируя всю остальную, ненужную генетическую информацию. Таким образом, полимеразная цепная реакция — это не само секвенирование, а ключевой подготовительный этап, обеспечивающий его осуществимость.

Полимеразная цепная реакция: создание необходимого материала для анализа

Полимеразная цепная реакция — это метод молекулярной биологии, который имитирует естественный процесс удвоения ДНК в клетке, но делает это в пробирке и в ускоренном темпе. Для запуска процесса в реакционную смесь помещают выделенную ДНК пациента, специальные короткие ДНК-зонды (праймеры), фермент ДНК-полимеразу и «строительные блоки» — нуклеотиды. Праймеры специфично связываются с началом и концом интересующего участка гена, давая команду полимеразе, какой именно фрагмент нужно копировать.

Процесс проходит в несколько циклов, каждый из которых состоит из трех стадий:

• Денатурация. Смесь нагревают примерно до 95 °C, чтобы двойная спираль ДНК «расплавилась» и разошлась на две отдельные цепи.
• Отжиг. Температуру снижают (обычно до 50–65 °C), чтобы праймеры могли найти комплементарные им участки на каждой из цепей ДНК и связаться с ними.
• Элонгация. Температуру снова повышают (до 72 °C), создавая оптимальные условия для работы ДНК-полимеразы. Фермент достраивает вторую цепь ДНК, начиная от праймера.

В результате каждого цикла количество копий целевого фрагмента ДНК удваивается. После 25–35 циклов, которые занимают всего несколько часов, из одной исходной молекулы образуются миллионы идентичных копий, готовых для дальнейшего анализа методом Сенгера.

Ключевые этапы взаимодействия ПЦР и секвенирования по Сенгеру

Процесс генетического анализа, включающий полимеразную цепную реакцию и метод Сенгера, представляет собой четко выстроенную последовательность действий. Каждый этап важен для получения достоверного конечного результата. Ниже представлена таблица, описывающая этот комплексный процесс.

Преимущества совместного использования ПЦР и метода Сенгера

Комбинация полимеразной цепной реакции и секвенирования по Сенгеру стала основой современной молекулярной диагностики благодаря ряду неоспоримых преимуществ. Их совместное применение позволяет проводить точные и надежные генетические исследования. Вот основные достоинства этого подхода:

• Высокая чувствительность. Благодаря ПЦР для анализа достаточно минимального количества биологического материала, иногда даже одной клетки. Это критически важно в пренатальной или онкологической диагностике.
• Исключительная специфичность. Использование праймеров, нацеленных на конкретный участок генома, гарантирует, что будет амплифицирован и проанализирован только интересующий фрагмент, а не случайные участки ДНК.
• Доступность и надежность. Метод Сенгера остается «золотым стандартом» точности для анализа относительно небольших фрагментов ДНК (до 1000 пар нуклеотидов), а ПЦР делает его доступным для рутинной клинической практики.
• Работа с деградированной ДНК. Полимеразная цепная реакция способна амплифицировать даже короткие фрагменты из частично разрушенных образцов ДНК, что невозможно для многих других методов.

Очистка продуктов ПЦР: обязательный шаг перед секвенированием

После завершения полимеразной цепной реакции в пробирке остается не только желаемый продукт (миллионы копий нужного фрагмента ДНК), но и множество «побочных» компонентов: неиспользованные праймеры, свободные нуклеотиды, ионы солей и фермент ДНК-полимераза. Если не удалить эти примеси, они будут серьезно мешать следующему этапу — секвенирующей реакции по Сенгеру. Например, оставшиеся праймеры могут запускать неспецифические реакции, а избыток нуклеотидов нарушит баланс, необходимый для правильной работы секвенирующего фермента.

Поэтому очистка продукта амплификации является критически важным промежуточным шагом. Существуют различные методы очистки: ферментативный (с использованием ферментов, разрушающих праймеры и нуклеотиды), сорбционный (с использованием специальных колонок, связывающих ДНК) и другие. Выбор метода зависит от лаборатории и конкретной задачи, но цель всегда одна — получить максимально чистый препарат амплифицированной ДНК, который обеспечит высокое качество и точность последующего секвенирования по Сенгеру.

Список литературы

1. Гинтер Е. К. Медицинская генетика: учебник. — М.: Медицина, 2003. — 448 с.
2. Сингер М., Берг П. Гены и геномы: в 2 т. / пер. с англ. — М.: Мир, 1998. — 391 с.
3. Жимулев И. Ф. Общая и молекулярная генетика: учебное пособие для студентов университетов. — Новосибирск: Сибирское университетское издательство, 2002. — 459 с.
4. ПЦР в реальном времени / Д. В. Ребриков, Г. А. Саматов, Д. Ю. Трофимов [и др.]. — М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. — 223 с.
5. Patrinos G. P., Ansorge W. J. Molecular Diagnostics: Current Technology and Applications. — Academic Press, 2016. — 722 p.