Подтверждение данных NGS методом Сэнгера для клинических заключений

Подтверждение данных, полученных методом секвенирования нового поколения (NGS), с помощью секвенирования по Сенгеру — это ключевой и обязательный этап для формирования достоверного клинического заключения. Хотя NGS позволяет быстро и эффективно анализировать большие участки генома, он имеет свои технологические ограничения, которые могут приводить к ошибкам. Метод Сенгера, в свою очередь, является «золотым стандартом» точности для анализа конкретного, уже известного участка ДНК. Поэтому когда NGS выявляет клинически значимый вариант, его верификация по Сенгеру служит финальной проверкой, гарантирующей максимальную надежность результата, на основе которого врач будет принимать решения о диагнозе, прогнозе и лечении.

Почему результаты секвенирования нового поколения требуют проверки

Секвенирование нового поколения (Next-Generation Sequencing, NGS) — это революционная технология, позволяющая одновременно «прочитывать» миллионы коротких фрагментов ДНК. Это делает его идеальным инструментом для широкого генетического поиска, например, при анализе целого экзома или генома. Однако у этой высокой производительности есть обратная сторона. Процесс может сопровождаться системными и случайными ошибками, которые создают «шум» в данных. Точность прочтения в некоторых участках генома может снижаться, что приводит к риску получения ложноположительных (когда вариант обнаружен, но его на самом деле нет) или ложноотрицательных (когда существующий вариант пропущен) результатов.

К основным причинам возможных неточностей NGS относятся:

• Артефакты, связанные с подготовкой образца и самой реакцией. Ошибки могут возникнуть на этапах фрагментации ДНК, прикрепления адаптеров или во время амплификации (размножения) фрагментов.
• Сложные участки генома. Некоторые области ДНК, богатые GC-парами или содержащие длинные повторы одинаковых нуклеотидов (гомополимеры), с трудом прочитываются технологией NGS.
• Неравномерное покрытие. «Покрытие» — это количество раз, которое был прочтен каждый конкретный нуклеотид. В некоторых участках оно может быть недостаточным для уверенного определения варианта.
• Ошибки биоинформатического анализа. Алгоритмы, которые «собирают» короткие прочтения в единую последовательность и ищут отличия от референтного генома, также могут допускать неточности.

В клинической практике, где цена ошибки — неверный диагноз или неправильно назначенное лечение, любая неопределенность недопустима. Поэтому все потенциально значимые находки, сделанные с помощью скринингового метода NGS, должны быть подтверждены более точным, «прицельным» методом.

Метод Сенгера как «золотой стандарт» валидации

Секвенирование по Сенгеру — это классический метод определения последовательности ДНК, разработанный Фредериком Сенгером еще в 1977 году. В отличие от массового параллельного подхода NGS, он анализирует один конкретный и относительно короткий фрагмент ДНК, но делает это с высочайшей точностью, близкой к 100 %. Этот метод работает по принципу терминации цепи: во время синтеза копии ДНК в реакцию добавляются специальные модифицированные нуклеотиды, которые останавливают рост цепи. В результате образуется набор фрагментов разной длины, что позволяет точно определить положение каждого нуклеотида.

Если NGS можно сравнить с поиском опечатки путем быстрого сканирования всей книги, то метод Сенгера — это как взять увеличительное стекло и внимательно изучить конкретное слово, на которое указал первичный поиск. Его высокая точность и надежность в анализе коротких участков сделали секвенирование по Сенгеру международно признанным «золотым стандартом» для подтверждения генетических вариантов. Именно он позволяет однозначно ответить на вопрос: действительно ли в данном месте генома есть изменение, обнаруженное NGS, или это была технологическая ошибка.

В каких случаях подтверждение методом Сенгера является обязательным

Необходимость подтверждения находок NGS методом Сенгера регулируется международными и национальными клиническими рекомендациями. Эта процедура является обязательной для всех вариантов, которые могут повлиять на клиническую тактику. Вот основные ситуации, когда валидация необходима:

• Обнаружение патогенных и вероятно патогенных вариантов. Если найденная мутация с высокой вероятностью является причиной заболевания, ее необходимо перепроверить перед постановкой окончательного диагноза.
• Варианты, определяющие тактику лечения. Например, в онкологии обнаружение определенных мутаций в опухоли может быть показанием к назначению дорогостоящей таргетной терапии. Ошибка в этом случае приведет к назначению неэффективного лечения.
• Результаты пренатальной и преимплантационной диагностики. Любые находки, влияющие на решение о судьбе беременности или выборе эмбриона для переноса, требуют безусловного подтверждения.
• Семейные исследования. При поиске мутации у родственников пациента (сегрегационный анализ) для подтверждения ее наследования.
• Варианты с низкой частотой аллеля. Когда мутация присутствует не во всех клетках (мозаицизм) или ее сигнал в данных NGS слабый, подтверждение помогает убедиться, что это не артефакт.
• Находки в технически сложных для NGS регионах генома. Если вариант обнаружен в области с низким покрытием или сложной структурой, его верификация по Сенгеру критически важна.

По сути, любое генетическое изменение, которое будет вписано в официальное медицинское заключение и на основе которого будут приниматься жизненно важные решения, должно быть верифицировано.

Как происходит процесс подтверждения: от результата NGS до заключения

Процесс валидации — это четко отлаженная лабораторная процедура, которая включает несколько последовательных этапов. Понимание этих шагов помогает осознать, почему для получения финального результата требуется дополнительное время.

1. Выявление варианта. После проведения секвенирования нового поколения врач-лабораторный генетик и биоинформатик анализируют огромный массив данных и выявляют один или несколько потенциально значимых генетических вариантов.
2. Принятие решения о валидации. Врач-генетик оценивает клиническую значимость находки. Если вариант классифицирован как патогенный или вероятно патогенный, принимается решение о его подтверждении.
3. Дизайн праймеров. Специалисты в лаборатории создают короткие одноцепочечные молекулы ДНК — праймеры. Они комплементарны участкам ДНК, расположенным до и после интересующего варианта. Праймеры служат «затравками», которые позволяют прицельно скопировать и размножить только нужный фрагмент генома.
4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). С помощью ПЦР и созданных праймеров из образца ДНК пациента нарабатывается большое количество копий именно того участка, где был найден вариант.
5. Секвенирование по Сенгеру. Полученные копии анализируются на секвенаторе по Сенгеру. Результат представляется в виде хроматограммы — графика с пиками разного цвета, где каждый пик соответствует определенному нуклеотиду.
6. Анализ и сравнение данных. Врач-лабораторный генетик сравнивает последовательность, полученную методом Сенгера, с результатом NGS. Если вариант подтверждается, он считается достоверным.
7. Формирование окончательного заключения. Подтвержденный вариант вносится в финальный отчет, который передается лечащему врачу и пациенту.

Что делать, если результаты NGS и секвенирования по Сенгеру не совпадают

Расхождение результатов — это рабочая ситуация, которая демонстрирует важность и необходимость валидации. Чаще всего встречается сценарий, когда вариант, обнаруженный при секвенировании нового поколения, не подтверждается методом Сенгера. Это означает, что первоначальная находка была ложноположительной, то есть артефактом технологии NGS. В этом случае вариант не вносится в заключение, и считается, что его у пациента нет. Это позитивный исход, поскольку система контроля качества сработала и уберегла от неверного диагноза.

Гораздо реже встречаются более сложные ситуации, которые требуют дополнительного анализа, например, при подозрении на мозаицизм низкого уровня. В любом случае, несоответствие результатов не является катастрофой. Напротив, это признак высокого стандарта работы лаборатории, которая использует многоуровневую систему проверки для обеспечения максимальной точности и надежности генетической диагностики. Окончательное заключение всегда формируется на основе наиболее достоверных данных, то есть на результате секвенирования по Сенгеру.

Сравнение NGS и метода Сенгера: два инструмента для одной цели

Чтобы лучше понять роль каждого метода, их ключевые характеристики можно обобщить. Для наглядности основные различия между двумя технологиями можно представить в виде таблицы:

Таким образом, NGS и секвенирование по Сенгеру — это не конкурирующие, а взаимодополняющие технологии. Их грамотное сочетание в клинической практике позволяет использовать сильные стороны каждой из них: широкие поисковые возможности NGS и высочайшую точность метода Сенгера. Этот двухэтапный подход обеспечивает пациентам и врачам уверенность в результатах генетического тестирования, что является фундаментом для современной персонализированной медицины.

Список литературы

1. Гинтер Е.К. Медицинская генетика: учебник. — М.: Медицина, 2003. — 448 с.
2. Бочков Н.П. Клиническая генетика: Учебник. 4-е изд., доп. и перераб. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. — 592 с.
3. Клинические рекомендации «Цистиноз». Разработчик: Ассоциация медицинских генетиков. Одобрено Научно-практическим Советом Минздрава РФ. – 2022.
4. Richards S., Aziz N., Bale S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015;17(5):405-424.
5. Rehm H.L., Bale S.J., Bayrak-Toydemir P., et al. ACMG clinical laboratory standards for next-generation sequencing. Genet Med. 2013;15(9):733-747.